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烟草是我国重要的经济作物之一。山地立体气候易导致烟草发生早花,使有效叶片数减少,影响产量和品质。在前期烟草基因表达谱检测和分析的基础上,筛选出了BR信号通路作为普通烟草早花响应苗期低温诱导的候选信号通路。为了了解普通烟草BR信号通路中关键基因家族NtBSK的特性和功能,参考AtBSK1、AtBSK2和AtBSK3,在中国烟草基因组数据库中同源比对找到同源的NtBSK1、NtBSK2和NtBSK3基因,通过生物信息学方法预测其结构特征。选择其中的NtBSK3基因,利用CRISPR/Cas9定点敲除体系检测了该技术对该基因的编辑效率并对突变基因进行生物信息学分析,随后探索了CRISPR/Cas9在烟草中介导基因定点敲除的可行性。外源喷施BR,利用qRT-PCR技术检测分析了NtBSK1、NtBSK2和NtBSK3及移码突变NtBSK3在处理过程中的表达量差异。其主要研究结果如下:1.以拟南芥的AtBSK1、AtBSK2和AtBSK3基因序列及蛋白质序列为基础序列,在烟草基因组数据库中进行比对,与之同源性最高的基因分别命名为NtBSK1、NtBSK2和NtBSK3。经生物信息学分析得到,NtBSK1/NtBSK2/NtBSK3 ORF分别为1464bp/1467bp/1488bp,所编码的氨基酸个数分别为487个/488个/495个,三者均含有一个激酶结构域PKc和一个三羧氨酸重复TPR结构域分别在N端和C端,即没有信号肽也没有跨膜区,但都有激酶识别位点,亲水性较强。这些都是类受体细胞质激酶亚家族基因成员的典型结构。在进化树上,NtBSK1与NtBSK2的同源关系更为接近,说明二者功能可能更为相近。2.利用CRISPR/Cas9技术对NtBSK3进行基因编辑,在位点1和位点2的突变率分别为55.0%(33/60)和63.5%(33/52),编辑效率达到75.6%。在NtBSK3突变体中有一段较长片段32bp的缺失,但修饰方式还是以单碱基的插入和小片段的缺失为主。对所有突变的位置检测,发现突变发生的位点几乎都在PAM序列上游毗邻第4位碱基上开始,和Cas9核酸酶切割DNA双链的位置完全吻合。对不同位点突变的NtBSK3基因进一步做生物信息学分析发现:发生移码突变的类型都破坏了TPR结构域,理论上非移码突变的类型没有破坏蛋白的结构域。位点1比位点2突变对蛋白结构域的破坏程度大,所以在设计靶位点时,在特异性好的情况下,尽量在靠前的外显子上进行选择。观察T0代植株发现:被编辑的突变株明显比野生型矮小。3.6片真叶野生型烟苗外源喷施BR和蒸馏水对照,结果表明:NtBSK1、NtBSK2和NtBSK3基因相对表达量在喷施BR的8h时间里,相对表达量呈上升趋势,在0-6h时间段,表达量上升相对缓慢。在6-8h时间段,表达量迅速上升,都在8h达到最大值。可以看出外源喷施BR有效地影响了植物体内BR信号通路途径;而且NtBSK1、NtBSK2、NtBSK3基因都参与了BR信号通路途径;其中NtBSK1的变化最大;在喷施蒸馏水对照的8h时间里,基因NtBSK1、NtBSK2和NtBSK3的相对表达量呈现正态分布,都在6h达到最大值。其中喷施BR表达量的最大值均大于喷施蒸馏水对照表达量的最大值。对移码突变阳性植株和假阳性植株分别外源喷施BR和蒸馏水对照,结果表明:假阳性植株的实时定量PCR结果与野生型的基本相同,而移码突变阳性转基因植株的相对表达量明显低于假阳性植株的相对表达量,而且外源喷施BR,其相对表达量虽有上升,但还是明显低于假阳性植株的表达量。