真核细胞核转录因子NFκB(Nuclear Factor-κ B)已证明广泛存在于各种细胞中，并参与多种基因的转录调控，包括细胞因子、细胞因子受体、细胞粘附因子介导的免疫反应和炎症反应和细胞调亡、细胞周期、细胞分化、细胞迁移及细胞放化疗耐药等病理生理过程的调控。 NFκB的激活既可以调节抗凋亡和促凋亡蛋白的表达，也可以调节细胞周期校正点的细胞周期蛋白的表达。包括P53、Bcl-2、IAPs、ClnD1及GADD45等等。目前为止受NFκB调控的基因已发现有150种之多。 研究发现多种肿瘤中NFκB高表达，包括胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌等等，抑制NFκB的表达后可促进化疗药物诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞。 NFκB对细胞调亡、细胞周期、细胞分化、细胞迁移及细胞放化疗耐药等病理生理过程的调控极其重要。然而，众多实验研究对于不同种类的肿瘤细胞，不同化疗药物所诱导凋亡途径中，NFκB所起的作用不尽相同。而且同一种药物对于不同种类细胞所诱导的凋亡途径中其NFκB所起的作用，P53与NFκB的关系，不同的NFκB抑制水平对凋亡所起的作用等等问题仍未明了，需要进一步研究。 喜树碱类药物CPTs(CPT11、TPT和HCPT)是DNA拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)抑制剂，能够抑制Topo Ⅰ将DNA断端重新接合的正常功能，造成DNA链的断裂损伤，抑浙江大学博士学位论文制ONA复制，阻断RNA合成，干扰细胞分裂周期，最终导致细胞死亡。文献报道CPTll和TPT均可以激活NF KB，使细胞凋亡受阻，阻断NF‘B信号转导途径后，能增强肿瘤细胞对CPTll和TPT的敏感性。 与众多研究不同，我们的前期研究发现NF KB在Bcap37细胞上发挥促进细胞凋亡的作用，紫杉醇和长春碱类药物均可以激活NF KB而诱导细胞凋亡，阻断N「KB的信号转导途径后细胞凋亡下降。 HcPT诱导乳腺癌细胞株Bcap37细胞凋亡和细胞周期阻滞的机制如何?NF KB在HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用又如何?这是一个让人感兴趣的课题。 因此，本研究以BcaP37细胞作为研究平台，结合我们的前期研究，旨在揭示HcPT诱导凋亡的分子机制;阐明NF KB在HCPT诱导凋亡发生过程中所起的作用;同时为寻找新的治疗靶点，设计新的治疗策略拓宽思路。 本论文的内容分以下六部分: 1.主要试剂配制方法和实验方法介绍 试剂配制方法主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)。主要实验方法有:MTT法;ONA琼脂糖凝胶电泳;western Blot;地高辛标记的EMSA;质粒转染;ONA和蛋白提取等等。 2.轻基喜树碱诱导乳腺癌BcaP37细胞株细胞凋亡和Gl/S期细胞周期阻滞 目的:观察HCPT是否诱导BcaP37细胞凋亡和细胞周期阻滞以及对NF KB信号转导途径的影响。 方法:通过DNA琼脂糖凝胶电泳、FCM、MTT、免疫细胞化学、DIG一EMSA和western Blot等方法。 结果:10~100林mol/L HCPT处理后Bcap37细胞生长受到抑制，出现凋亡条带以及细胞周期阻滞;HCPT可以降解I虑一a，激活NF KB。 结论:HCPT可以诱导BcaP37细胞凋亡和G 115期的细胞周期阻滞;可通过降解l仍心激活NF KB信号转导途径。浙江大学博士学位论文 3.轻基喜树碱诱导乳腺癌Bcap37细胞株细胞凋亡和细胞周期阻滞的分子机制 目的:探讨HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的具体分子机制。 方法:通过DNA琼脂糖凝胶电泳、DIG一EMSA和Western Blot等方法。 结果:HCPT可以上调P53、P21和Bax的表达，下调Bcl一2和CDK4/ClnDI，促进Pro一caspase3的降解，对COKI/c InBI没有影响，OEvo一CHo可以抑制细胞凋亡，抑制NF KB的激活。 结论:HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞过程中涉及P53、P21、Bax、Bcl一2、cDK4lC吸nDI和pro一casPase3等蛋白表达的变化。 4.突变1 KB一Q基因对轻基喜树碱诱导乳腺癌Bcap37细胞株细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响 目的:探讨!KB一留NF KB信号转导途径在HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用。 方法:用质粒转染、MTT、DNA琼脂搪凝胶电泳、FCM、Western Blot、o一G一EMSA等方法。 结果:成功转染突变IKB一a质粒并选择克隆:质粒转染对细胞生长没有影响;突变IKB一Q抑制了HCPT对N「KB的激活，也抑制了HCPT对细胞诱导的凋亡和细胞周期阻滞，并下调T P53、PZ一、和Bax蛋白的表达，上调CDK4/C InDI和Bcl一2的表达。 结论:IKB一留NF KB信号转导途径在HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞过程中有促进作用。5.工KB激酶抑制剂Bay 1 1 7082对轻基喜树碱诱导乳腺癌B。ap37细胞株细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响目的:探讨NF KB抑制剂Bayll对HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响:进 浙江大学博士学位论文一步研究I沼一口NF KB信号转导途径在HCPT诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用。 方法:用MTT、DNA琼脂糖凝胶电泳、FCM、Western Blot、DIG一EMSA等方法。 结果:5林mol儿Bayl 17082抑制了HcPT对NFKB的激活，也抑制了细胞凋亡和细 胞周期阻滞，并下调