赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）是由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌产生的次级代谢产物，它是食品和饲料中的主要污染物之一，经常出现在各种各样的食物中，包括谷类、咖啡、葡萄等。其毒性作用主要包括肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸作用、致癌作用等，因而，大部分国家均规定了OTA的限量标准。目前，OTA的检测主要有仪器学方法和免疫学方法，而免疫学方法以其独特的优点得到了广泛的应用。　　金标免疫斑点法（Dot Immunogold Filtration Assay，DIGFA）是免疫学检测方法的一种，它以快速、简便、成本低、不需专业技术人员等优点成为研究、应用的热门。　　由于OTA是一种半抗原，本研究采用活性酯法合成OTA完全抗原，并将完全抗原进行紫外可见光谱扫描，确证完全抗原合成成功。使用OTA-BSA完全抗原免疫试验用动物，对得到的抗血清使用酶联免疫吸附法（ Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）进行检测，得到了高灵敏度及高特异性的抗 OTA多克隆抗体。随后，对此多克隆抗体进行纯化，建立了检测OTA的DIGFA，并使用了DIGFA对实际样品进行检测，具体内容如下。　　1抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备　　OTA是一种小分子抗原，分子量仅为403.8，没有免疫原性，只有反应原性，故称为半抗原。这种半抗原需要与大分子物质（如蛋白质等）偶联形成完全抗原，才能刺激机体产生抗体。本研究依据OTA含有的典型羧基，采用活性酯法使OTA与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）偶联，形成OTA-BSA免疫抗原与OTA-OVA包被抗原。然后，通过紫外可见光谱对这两种完全抗原进行分析，完全抗原中OTA的特征吸收峰从333 nm红移到380 nm，这是由于在蛋白质的作用下， OTA中酚羟基的解离程度发生改变，从而导致吸收峰发生红移。另外，完全抗原中的蛋白吸收峰较OTA也有显著升高，这些都间接表明完全抗原构建成功。　　使用制备好的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，45μg/只/次，免疫周期为4周，3周，3周。三只小鼠在二免后均对 OTA产生免疫应答，不同小鼠应答程度不同，但总体相差不大。三只小鼠效价均在105以上。从抗体竞争抑制曲线可知，三免后，1＃小鼠灵敏度约5 ng/mL，2＃小鼠约为8 ng/mL，3＃小鼠约为50 ng/mL。　　对试验兔子使用免疫抗原OTA-BSA进行免疫，200μg/次/只，免疫周期为1个月，从抗体产生曲线可知，两只兔子均对OTA产生免疫应答，其效价均在105以上。三免后，1＃兔灵敏度约达到了8 ng/mL，2＃兔子灵敏度约达到了20 ng/mL。通过对抗血清进行特异性检测，可以看出，抗OTA血清与ZEN、AFB1、CIT均无交叉反应，特异性较好，可满足实际检测需求。且拿到1＃与2＃兔抗血清各60 mL左右，其量完全可用于后续试验。　　2金标免疫斑点法检测OTA的研究　　本章建立了检测OTA的DIGFA法，在确定了胶体金标记的最佳pH值及最佳包被量后，将纯化后的抗 OTA抗体标记到胶体金上，得到胶体金探针。对胶体金探针进行质量鉴定表明，抗OTA抗体标记到胶体金上，且质量较好，可用于后续试验。　　在间接竞争ELISA基础上，以OTA-OVA作为包被抗原，抗OTA的金标探针为分析探针，初步建立了检测 OTA的 DIGFA法。通过对该法的灵敏度检测，得到的 OTA的检测限为10 ng/mL。且该方法对AFB1、ZEN、CIT的特异性较好，无交叉反应，可初步用于检测实际样品。　　3金标免疫斑点法在实际样品检测中的应用　　采用第三章建立的DIGFA法对加标回收样品及9种常见农产品进行检测，加标回收中0和10 ng/mL的加标样品有红色斑点出现，20，30，40 ng/mL的加标样品无红色斑点出现，而9种农产品均有红色斑点出现，结果均为阴性。　　使用ELISA法检测加标回收样品与实际样品，以1＃兔血清作为检测血清，在1-100 ng/mL的线性范围内，建立了ELISA标准曲线。在ELISA标准曲线基础上，加标OTA的平均回收率在67％-88.13%之间，变异系数均在5.57%-12%之间。对9种常见农产品进行检测后，检测结果均为阴性。