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赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)真菌产生的次级代谢产物,它是食品和饲料中的主要污染物之一,经常出现在各种各样的食物中,包括谷类、咖啡、葡萄等。其毒性作用主要包括肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸作用、致癌作用等,因而,大部分国家均规定了OTA的限量标准。目前,OTA的检测主要有仪器学方法和免疫学方法,而免疫学方法以其独特的优点得到了广泛的应用。 金标免疫斑点法(Dot Immunogold Filtration Assay,DIGFA)是免疫学检测方法的一种,它以快速、简便、成本低、不需专业技术人员等优点成为研究、应用的热门。 由于OTA是一种半抗原,本研究采用活性酯法合成OTA完全抗原,并将完全抗原进行紫外可见光谱扫描,确证完全抗原合成成功。使用OTA-BSA完全抗原免疫试验用动物,对得到的抗血清使用酶联免疫吸附法( Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)进行检测,得到了高灵敏度及高特异性的抗 OTA多克隆抗体。随后,对此多克隆抗体进行纯化,建立了检测OTA的DIGFA,并使用了DIGFA对实际样品进行检测,具体内容如下。 1抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备 OTA是一种小分子抗原,分子量仅为403.8,没有免疫原性,只有反应原性,故称为半抗原。这种半抗原需要与大分子物质(如蛋白质等)偶联形成完全抗原,才能刺激机体产生抗体。本研究依据OTA含有的典型羧基,采用活性酯法使OTA与牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)偶联,形成OTA-BSA免疫抗原与OTA-OVA包被抗原。然后,通过紫外可见光谱对这两种完全抗原进行分析,完全抗原中OTA的特征吸收峰从333 nm红移到380 nm,这是由于在蛋白质的作用下, OTA中酚羟基的解离程度发生改变,从而导致吸收峰发生红移。另外,完全抗原中的蛋白吸收峰较OTA也有显著升高,这些都间接表明完全抗原构建成功。 使用制备好的免疫抗原免疫BALB/c小鼠,45μg/只/次,免疫周期为4周,3周,3周。三只小鼠在二免后均对 OTA产生免疫应答,不同小鼠应答程度不同,但总体相差不大。三只小鼠效价均在105以上。从抗体竞争抑制曲线可知,三免后,1#小鼠灵敏度约5 ng/mL,2#小鼠约为8 ng/mL,3#小鼠约为50 ng/mL。 对试验兔子使用免疫抗原OTA-BSA进行免疫,200μg/次/只,免疫周期为1个月,从抗体产生曲线可知,两只兔子均对OTA产生免疫应答,其效价均在105以上。三免后,1#兔灵敏度约达到了8 ng/mL,2#兔子灵敏度约达到了20 ng/mL。通过对抗血清进行特异性检测,可以看出,抗OTA血清与ZEN、AFB1、CIT均无交叉反应,特异性较好,可满足实际检测需求。且拿到1#与2#兔抗血清各60 mL左右,其量完全可用于后续试验。 2金标免疫斑点法检测OTA的研究 本章建立了检测OTA的DIGFA法,在确定了胶体金标记的最佳pH值及最佳包被量后,将纯化后的抗 OTA抗体标记到胶体金上,得到胶体金探针。对胶体金探针进行质量鉴定表明,抗OTA抗体标记到胶体金上,且质量较好,可用于后续试验。 在间接竞争ELISA基础上,以OTA-OVA作为包被抗原,抗OTA的金标探针为分析探针,初步建立了检测 OTA的 DIGFA法。通过对该法的灵敏度检测,得到的 OTA的检测限为10 ng/mL。且该方法对AFB1、ZEN、CIT的特异性较好,无交叉反应,可初步用于检测实际样品。 3金标免疫斑点法在实际样品检测中的应用 采用第三章建立的DIGFA法对加标回收样品及9种常见农产品进行检测,加标回收中0和10 ng/mL的加标样品有红色斑点出现,20,30,40 ng/mL的加标样品无红色斑点出现,而9种农产品均有红色斑点出现,结果均为阴性。 使用ELISA法检测加标回收样品与实际样品,以1#兔血清作为检测血清,在1-100 ng/mL的线性范围内,建立了ELISA标准曲线。在ELISA标准曲线基础上,加标OTA的平均回收率在67%-88.13%之间,变异系数均在5.57%-12%之间。对9种常见农产品进行检测后,检测结果均为阴性。