研究背景与目的：结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例约120万例,死亡人数达60万。在我国,结直肠癌位居恶性肿瘤死亡率第四位。近年来,我国结直肠癌的发病和死亡呈明显上升趋势。结直肠癌的发生、发展是一个涉及多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。80%以上的结直肠癌是从腺瘤癌变而来,而从腺瘤的发生至癌变的发生、发展,主要涉及癌基因、抑癌基因、错配修复基因等三类基因的变化。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起关键作用,其失活或缺失可导致细胞去调节性生长,克隆性扩张。因此,在结直肠癌病因学研究中,有必要寻找与其发生、发展相关的抑癌基因,探讨其在疾病发生发展中的作用,进一步从分子水平阐明结直肠癌的发病机制,为疾病的早发现、早诊断和早治疗提供重要的理论基础。本课题组前期研究采用荧光差异双向电泳技术构建了不同临床分期结直肠癌蛋白质差异表达谱,发现琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)是结直肠癌发病过程中一个差异表达蛋白质分子,可能具有潜在的抑癌功能。SDH也称为线粒体复合物Ⅱ,定位于线粒体内膜,是由A、B、C、D四个亚基组成的异源四聚体,分别由相应的核基因编码。SDH是三羧酸循环和线粒体呼吸链的组成部分,其在细胞能量代谢中起到重要的作用。SDH作为一个抑癌基因,其基因缺陷或表达异常与多种疾病的发生有关,如副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾癌、胃肠道间质瘤、Leigh综合征等。前期研究中我们利用免疫组化技术检测了包含103例病例的结直肠组织芯片中SDH的表达情况,发现SDHB蛋白在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且SDHB在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。目前对SDH基因在结直肠癌发生发展中的作用及机制国内外尚未见报道。本课题在前期工作的基础上,扩大样本量检测SDHB在低分化结肠癌组织中的表达以进一步证实SDHB的表达与结肠癌分化程度的关系。为了进一步深入研究SDHB基因在结直肠癌发生发展中的作用,我们构建了SDHB过表达稳定转染细胞系以明确SDHB基因对结肠癌细胞SW620生物学行为的影响。同时研究了SDHB基因对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,我们从SDHB基因突变和启动子甲基化两个方面对SDHB在结直肠癌中表达下调的机制进行了探讨。方法：本研究在包含32个点阵的低分化结肠癌组织芯片中应用免疫组化技术检测了SDHB蛋白的表达。而后采用真核表达载体pIRESneo3构建了SDHB基因稳定表达载体pIRES-SDHB,利用脂质体转染的方法将其导入SW620细胞,建立了SDHB稳定转染结肠癌细胞系。通过细胞生长曲线、平板集落形成、裸鼠移植瘤形成试验等明确SDHB对结肠癌细胞生长与增殖的作用。通过流式细胞仪检测SDHB对SW620细胞周期的影响,同时采用Western blot及免疫细胞化学法分别检测细胞周期相关分子cyclin D1和PCNA的表达。通过构建人全基因组表达谱芯片探究了SDHB基因过表达对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,提取了40对结直肠癌及配对的癌旁正常结直肠粘膜组织gDNA,一方面采用PCR扩增了SDHB基因各外显子片段,产物纯化后进行双向测序检测各外显子突变情况；另一方面将gDNA经亚硫酸氢盐修饰后,采用甲基化特异性PCR检测SDHB基因启动子甲基化状态。结果：(1) SDHB在结直肠癌组织中的表达①免疫组织化学检测SDHB蛋白在结直肠癌组织芯片中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且其在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化明显减弱。②Western blot检测SDHB蛋白在结直肠癌组织中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织中表达正常粘膜组织明显减弱。(2) SDHB基因转染对结肠癌SW620细胞生物学功能的影响①细胞生长曲线显示转染SDHB基因显著抑制了SW620细胞的生长。②平板集落形成试验显示转染SDHB基因显著抑制SW620细胞的集落形成能力。③裸鼠移植瘤形成实验表明SDHB抑制结肠癌SW620细胞致瘤性。④流式细胞仪检测发现稳定转染SDHB基因导致SW620细胞周期发生G1-S期阻滞。⑤Western blot及免疫细胞化学法检测发现SDHB下调SW620细胞中cyclin D1及PCNA的表达。(3) SDHB对结肠癌细胞基因表达谱的影响①采用Illumina公司的人全基因组表达谱芯片(Human HT-12v4)共筛选出受SDHB基因调控结肠癌SW620细胞中差异表达的基因共1653个,其中上调基因1382个,下调基因271个。②采用real-time PCR验证了部分差异表达基因,结果与芯片检测结果一致,说明芯片数据可靠。③GO分析发现差异表达基因主要参与细胞周期及其调控、细胞增殖调控、转录调控、细胞信号传导等过程。④KEGG数据库分析发现差异表达基因主要参与p53、MAPK、 Toll样受体、ErbB、Jak-STAT、T细胞受体、Notch、Wnt、TGF-β、 VEGF、细胞因子相互作用等信号传导途径。(4) SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制①PCR扩增SDHB基因各外显子片段,测序后发现在40例结直肠癌和与配对的正常结直肠粘膜组织标本中SDHB基因第一外显子第18个碱基处存在一个SNP位点,碱基由C颠换成A,致第6位密码子由GCC变为GCA,两个密码子均编码丙氨酸,为一同义突变；未发现致病性突变。结果提示SDHB基因外显子突变可能不是单纯性结直肠癌的致病原因。②MSP法未能在上述40对组织中检测出SDHB基因启动子区CpG岛甲基化,推测SDHB在结肠癌组织中表达下调可能不是由启动子区甲基化引起的。结论：(1) SDHB在结直肠癌组织中表达下调,且表达水平与结直肠癌组织分化程度相关,在低分化癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。(2)SDHB可抑制体外SW620细胞的生长与增殖,诱导细胞G1-S期阻滞；抑制SW620细胞裸鼠皮下移植瘤的形成。(3) SDHB基因外显子点突变和启动子区甲基化可能不是SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制。