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研究背景与目的：在乳腺癌患者中ER阳性的患者约70%-80%，其主要治疗方式是以他莫昔芬为主的内分泌治疗，据临床统计数据术后持续5年的他莫昔芬治疗减少了患者51%的复发率和28%的死亡率，但是长期使用他莫昔芬后会出现耐药。他莫昔芬耐受是乳腺癌内分泌治疗出现复发难治的重要原因。有文献报道miR-221/222能够通过Cip/Kip家族(p21,p27,p57),ER-α,TIMP3,FOXO3A,PUMA和PTEN等靶标基因影响他莫昔芬耐药，miR-221/222在乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中过表达，抑制miR-221/222表达后，乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性得到恢复。为了实现miRNA功能的丧失，miRNA海绵技术被开发出来，利用质粒或病毒载体来实现细胞内串联排列、突出的与miRNA种子序列互补的DNA高水平表达，从而对miRNA功能进行短暂或长期的抑制。利用miRNA家族成员共享一个共同的种子序列的优势，这项技术在敲除一个miRNA家族的表达方面尤为有用，为同时用单一抑制剂抑制多个感兴趣的miRNA提供了强有力的手段。因此，本课题拟设计miRNA海绵体吸附miR-221/222使其失功能，为了实现临床转化，将其构建到端粒酶逆转录酶启动子的质粒中，使其在癌细胞中特异性的表达，进而恢复乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。
材料与方法：使用高浓度他莫昔芬持续冲击诱导法建立乳腺癌他莫昔芬耐药的细胞模型：MCF-7-TamR，通过CCK8法检测MCF-7-TamR的IC50对其进行鉴定，并观察MCF-7-TamR的形态学变化以及通过荧光定量PCR和WesternBlot检测相关蛋白标志物的变化。设计合成miR-221/222海绵，通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA胶回收、连接、质粒大提等将海绵克隆到带有端粒酶逆转录酶启动子的质粒中，用生物素标记的RNApull-down技术验证miR-221/222海绵与miR-221/222的结合，利用CCK8细胞活性检测、qRT-PCR、westernblot、transwell实验和3D细胞培养等方法研究证明miR-221/222海绵逆转乳腺癌他莫昔芬耐药的效果及作用机制。
实验结果：通过高浓度他莫昔芬诱导冲击成功建立乳腺癌他莫昔芬耐药细胞模型MCF-7-TamR，使用荧光定量PCR检测发现在MCF-7-TamR中miR-221和miR-222表达明显升高，抑制miR-221和miR-222后MCF-7-TamR细胞对他莫昔芬敏感性增加，因为miRNA海绵体能同时沉默miR-221和miR-222，且能构建到质粒中使其稳定持续的高表达进而使miR-221和miR-222失功能，我们设计合成了miR-221/222海绵，为了使miR-221/222海绵具有肿瘤特异性，使用了端粒酶逆转录酶启动子驱使miR-221/222海绵表达，hTERT-miR-221/222海绵转染到MCF-7-TamR细胞后，CCK8实验发现hTERT-miR-221/222海绵能逆转细胞对他莫昔芬的耐药性，并使miR-221和miR-222的靶基因ERα、P27和PTEN的表达升高。hTERT-miR-221/222海绵只在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中表达极低，对正常细胞的影响较小。为了进一步验证hTERT-miR-221/222海绵的效果，我们在3D培养条件下进行以观察，发现在三维培养环境中hTERT-miR-221/222海绵同样能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞的生长及增殖。
海绵具有肿瘤特异性，使用了端粒酶逆转录酶启动子驱使miR-221/222海绵表达，hTERT-miR-221/222海绵转染到MCF-7-TamR细胞后，CCK8实验发现hTERT-miR-221/222海绵能逆转细胞对他莫昔芬的耐药性，并使miR-221和miR-222的靶基因ERα、P27和PTEN的表达升高。hTERT-miR-221/222海绵只在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中表达极低，对正常细胞的影响较小。为了进一步验证hTERT-miR-221/222海绵的效果，我们在3D培养条件下进行以观察，发现在三维培养环境中hTERT-miR-221/222海绵同样能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞的生长及增殖。
结论：
1.hTERT-miR-221/222海绵体具有肿瘤特异性，转染后在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中低表达。
2.hTERT-miR-221/222海绵体上调miR-221/222靶基因ERα、PTEN、P27以及EMT相关标志物的表达，抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭并影响其细胞周期。
3.hTERT-miR-221/222海绵体逆转MCF-7-TamR细胞对他莫昔芬耐药，使其恢复对他莫昔芬的敏感性。
4.在3D培养环境中，hTERT-miR-221/222海绵体能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞生长及增殖能力。
综上所述，hTERT-miR-221/222海绵体具有临床转化潜力。
材料与方法：使用高浓度他莫昔芬持续冲击诱导法建立乳腺癌他莫昔芬耐药的细胞模型：MCF-7-TamR，通过CCK8法检测MCF-7-TamR的IC50对其进行鉴定，并观察MCF-7-TamR的形态学变化以及通过荧光定量PCR和WesternBlot检测相关蛋白标志物的变化。设计合成miR-221/222海绵，通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA胶回收、连接、质粒大提等将海绵克隆到带有端粒酶逆转录酶启动子的质粒中，用生物素标记的RNApull-down技术验证miR-221/222海绵与miR-221/222的结合，利用CCK8细胞活性检测、qRT-PCR、westernblot、transwell实验和3D细胞培养等方法研究证明miR-221/222海绵逆转乳腺癌他莫昔芬耐药的效果及作用机制。
实验结果：通过高浓度他莫昔芬诱导冲击成功建立乳腺癌他莫昔芬耐药细胞模型MCF-7-TamR，使用荧光定量PCR检测发现在MCF-7-TamR中miR-221和miR-222表达明显升高，抑制miR-221和miR-222后MCF-7-TamR细胞对他莫昔芬敏感性增加，因为miRNA海绵体能同时沉默miR-221和miR-222，且能构建到质粒中使其稳定持续的高表达进而使miR-221和miR-222失功能，我们设计合成了miR-221/222海绵，为了使miR-221/222海绵具有肿瘤特异性，使用了端粒酶逆转录酶启动子驱使miR-221/222海绵表达，hTERT-miR-221/222海绵转染到MCF-7-TamR细胞后，CCK8实验发现hTERT-miR-221/222海绵能逆转细胞对他莫昔芬的耐药性，并使miR-221和miR-222的靶基因ERα、P27和PTEN的表达升高。hTERT-miR-221/222海绵只在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中表达极低，对正常细胞的影响较小。为了进一步验证hTERT-miR-221/222海绵的效果，我们在3D培养条件下进行以观察，发现在三维培养环境中hTERT-miR-221/222海绵同样能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞的生长及增殖。
海绵具有肿瘤特异性，使用了端粒酶逆转录酶启动子驱使miR-221/222海绵表达，hTERT-miR-221/222海绵转染到MCF-7-TamR细胞后，CCK8实验发现hTERT-miR-221/222海绵能逆转细胞对他莫昔芬的耐药性，并使miR-221和miR-222的靶基因ERα、P27和PTEN的表达升高。hTERT-miR-221/222海绵只在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中表达极低，对正常细胞的影响较小。为了进一步验证hTERT-miR-221/222海绵的效果，我们在3D培养条件下进行以观察，发现在三维培养环境中hTERT-miR-221/222海绵同样能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞的生长及增殖。
结论：
1.hTERT-miR-221/222海绵体具有肿瘤特异性，转染后在乳腺癌细胞中高表达，在乳腺正常细胞中低表达。
2.hTERT-miR-221/222海绵体上调miR-221/222靶基因ERα、PTEN、P27以及EMT相关标志物的表达，抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭并影响其细胞周期。
3.hTERT-miR-221/222海绵体逆转MCF-7-TamR细胞对他莫昔芬耐药，使其恢复对他莫昔芬的敏感性。
4.在3D培养环境中，hTERT-miR-221/222海绵体能抑制乳腺癌他莫昔芬耐药细胞生长及增殖能力。
综上所述，hTERT-miR-221/222海绵体具有临床转化潜力。