柳属种类繁多,全世界共有520多种,我国有257个种,122个变种,33个变型。柳属是重要的造林绿化、用材树种,具有治水、固沙、改碱的作用,有较高的经济和生态价值。但柳属的分类是世界难题,有关柳属的资源创新与利用研究也有待我们大力开发。本文以黑龙江省柳属种质资源为研究对象,构建了以形态学鉴定、扫描电镜观察、分子学鉴定和化学成分鉴定相结合的模式,有效地提高了鉴定准确率,为柳属的分类提供科学证据。为挖掘柳属优良性状,合理开发利用柳属资源,研究采用层次分析法对柳属的生长指标和药用指标进行综合评价,筛选出6种具有优良性状的柳属植物,可作为柳属遗传育种研究的优良种质。本论文的主要研究内容及结果如下:1.构建柳属系统鉴定模式,为柳属的分类研究提供新思路(1)以传统形态学鉴定为预鉴定:在黑龙江省哈尔滨、大庆、伊春和塔河县共收集了 56份柳属植物样本,根据《中国植物志》、《黑龙江省植物检索表》对柳属的形态描述,鉴定结果为14组29个种,2个变种,2个变型和1个杂交种。29个种包括柳组(圆头柳Salix capitata、垂柳 Salix babylonica、旱柳Salix matsudana、朝鲜柳 Salix koreensis、长柱柳Salix eriocarpa、白皮柳Salix pierotii和爆竹柳Salix fragilis),蒿柳组(毛枝柳Salix dasyclados、龙江柳Salix sachalinensis、蒿柳Salia viminalis和卷边柳Salix siuzevii),黄花柳组(谷柳 Salix taraikensis、大黄柳 Salix raddeana、兴安柳Salix hsinganica和崖柳Salix floderusii),粉枝柳组(粉枝柳Salix rorida 和司氏柳Salix skvortzovii),筐柳组(筐柳 Salix linearistipularis和松江柳Salix sungkianica),三蕊柳组(三蕊柳Salix triandra),五蕊柳组(五蕊柳Salix pentandra),沼柳组(细叶沼柳Salix rosmarinifolia),越桔柳组(越桔柳Salix myrtilloides),细柱柳组(细柱柳Salix gracilistyla),杞柳组(杞柳 Salix integra),大白柳组(大白柳Salix maximowiczii),乌柳组(乌柳Salix cheilophila),鹿蹄柳组(鹿蹄柳Salix pyrolifolia)以及收录在《中国高等植物图鉴》的深山柳(东陵山柳)Salix phylicifolia;2个变种包括旱垂柳Salix matsudana var.pseudo-matsudana(旱柳变种)和沼柳 Salix rosmarinifolia var.brachypoda(细叶沼柳变种);2个变型包括龙爪柳Sulix matsudana var.tortuosa(旱柳变型)和馒头柳Salix matsudan var.natsudanaa f.umbraculifera(旱柳变型);杂交种为金丝垂柳Salix babylonica ×S.alba-vitellina。以微观形貌特征为辅助鉴定:对于形态相近不易区分的物种,进行叶表皮和花粉的扫描电镜观察,观察叶表皮特征能够区别形态相近的五蕊柳与三蕊柳,旱柳与旱垂柳;由于花粉具有遗传稳定性好的特点,本论文对花粉的形态、P/E值、萌发孔数、外壁纹饰等特征参数,进行了详细描述。(3)以分子学鉴定为精准鉴定:采用DNA条形码技术,对柳属的ITS2序列、psbA-trnH序列进行PCR扩增并双向测序,构建了系统发育树。结果发现叶绿体片段的柳属分辨率远远低于核基因组片段。ITS2序列可对五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳和钻天柳进行精准鉴定,达到种级别,对柳组部分物种仅可鉴定到组级别。(4)以化学成分鉴定为复核鉴定:采用高效液相色谱法(HPLC)对柳属提取物成分进行测定,绘制HPLC指纹图谱,通过比较分析样品共有峰的数量和相似度,能够对形态学与分子学鉴定所得结果一致的进行复核,同时也能排除不确定的相似种。2.丰富柳属基因数据信息,保存柳属基因资源(1)利用流式细胞仪测定柳属染色体倍性及基因组大小:以二倍体杞柳为对照品,根据流式图谱中的荧光强度计算染色体倍性水平和DNA含量,结果筐柳、乌柳为二倍体;金丝垂柳、龙爪柳、圆头柳、旱柳、五蕊柳、三蕊柳、旱垂柳和垂柳为四倍体;深山柳为六倍体;以黄瓜(350 Mb)和大豆(1150 Mb)为对照品,测试柳属基因组大小范围为:乌柳(290.69～305.76 Mb)、圆头柳(628.22～656.93 Mb)、五蕊柳(569.76～612.54 Mb)、三蕊柳(569.76～612.41 Mb)、垂柳(565.51～629.09 Mb)、杞柳(285.51～312.63 Mb)。(2)目前Genbank中柳属的ITS序列2047条。本研究在核基因片段的扩增和测序中得到了较好的结果,获得40条ITS2序列提交至GenBank,注册编号为:MT177150,MT177151,MT177152,MT177153,MT177154,MT177155,MT177156,MT177157,MT177158,MT177159,MT177160,MT177161,MT177162,MT177163,MT177164,MT177165,MH924219,MT177166,MT177167,MT177168,MT177169,MT177170,MT177171,MT177172,MT177173,MT177174,MT177175,MT177176,MT177177,MT177178,MT177179,MT177180,MT177181,MT177182,MT177183,MT177184,MT177185,MT177186,MT177187,MH924218。其中包括钻天柳Chosenia arbutifolia 3条序列(MT177178,MT177179,MT177180)和柳属 37 条序列,其中白皮柳Salixpierotii(MT177150)、圆头柳Salix capitata(MH924219,MT177162)、乌柳Salix cheilophila(MH924218)、筐柳Salix linearistipularis(MT177181,MT177182)和卷边柳 Salix siuzevii(MT177183,MT177184,MT177185,MT177186)共计 10 条序列是首次提交 ITS2序列的柳属,丰富了柳属DNA信息资源。3.科学评价柳属资源,筛选柳属优良种质采用层次分析法,构建柳属种质资源评价模型,设立了两个准则层指标,即生长指标和药用指标。根据调查问卷评分结果,建立判断矩阵并计算7个因子层指标及其权重:树高0.1332,胸径0.1263,冠幅0.0470,分枝数0.0271,总黄酮含量0.2079,原花青素含量0.1317和木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量0.3268。利用紫外-可见分光光度计和高效液相色谱仪检测柳属叶片中总黄酮、原花青素,木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量,对柳属资源价值进行定性、定量的综合判断并计算分数,筛选出排名前六的柳属:旱垂柳Salix matsudana var.pseudo-matsudana,五蕊柳Salix pentandra,筐柳Salix linearistipularis,金丝垂柳 Salix babylonica ×S.alba-vitellina,旱柳 Salix matsudana和垂柳 Salix babylonica。4.资源创新与利用,发掘柳属药用植物价值(1)采用标准差法进行分组,将柳属中总黄酮、原花青素和木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量数据划分为高、中、低三组,3种成分在三个组别间差异达到极显著(P<0.001)水平。研究考察了哈尔滨地区11种柳属3种成分在6月至10月的动态含量变化,结果发现:总黄酮量在10月份仍然稳定,因此可以利用落叶资源进行提取;原花青素8月份含量较高到9月基本降解;木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷被证实是治疗心脑血管疾病很好的活性物质,在8月份含量最高;测试26种柳属其中18种含有木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,含量较高的柳属为五蕊柳2.1307 mg/g;筐柳1.3557 mg/g;细叶沼柳 1.1947mg/g;杞柳 1.1210 mg/g 和圆头柳 1.0747 mg/g。(2)柳酸(水杨酸)最早从柳树发现,后被合成了阿司匹林。研究以水杨酸为底物,设计合成8种水杨酸类席夫碱化合物并对其化学结构予以表征,其中4种2-羟基-4-(2-羟基-4-二乙氨基苯基亚氨基)苯甲酸(3d)、2-羟基-5-(2-羟基-4-氯苯基亚氨基)苯甲酸(4b)、2-羟基-5-(2-羟基-4-溴苯基亚氨基)苯甲酸(4c)、2-羟基-5-(2-羟基-5-二乙氨基苯基亚氨基)苯甲酸(4d)为首次合成的新型化合物。采用滤纸片法测试产物的抑菌活性,结果发现产物在浓度为8 mg/mL和16 mg/mL时对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定抑制作用,其中抑菌活性较好的是2-羟基-4-(2-羟基-5-溴苯基亚氨基)苯甲酸(3c)对三者的抑菌圈直径分别为18.5 mm,23.5 mm,20.2 mm;2-羟基-5-(2-羟基-4-溴苯基亚氨基)苯甲酸(4c)抑菌圈直径分别为14.1 mm,22.5 mm,12.2 mm。综上所述,本文围绕柳属植物的系统鉴定与种质资源开发利用这一主旨进行研究,采用传统形态学、微观形貌、分子标记、细胞生物学和化学分析对黑龙江省柳属植物14个组29种及其变种与变型进行了综合研究,构建了柳属植物鉴定的新模式,提高了柳属鉴定的精确度;采用层次分析法对柳属种质资源进行评价,为柳属遗传育种的研究筛选出6种优良种质;通过对柳属药用成分总黄酮、原花青素和木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量的检测和水杨酸类席夫碱化合物合成研究,开发柳属植物的药用价值,为柳属优良种质资源开发与合理有效利用提供科学依据。