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棉花是集纤维、蛋白和油脂一体的重要经济作物。成熟棉花种子含油量可达36～45%,其中约70%为易氧化的亚油酸(C18:2?9,12)等不饱和脂肪酸组成。种子油脂的氧化不仅影响成品油加工和品质以及种子耐储性,亦可降低种子活力和萌发率,损伤幼苗形态建成和生长发育。引起种子脂肪过氧化的关键酶是脂氧合酶（Lipoxygenase,LOX,EC 1.13.11.12）。LOX是含有非血红素离子的双加氧酶,能够催化不饱和脂肪酸（亚油酸和亚麻酸等）及其相应酯的加氧反应,生成相应的含有共轭双键的氢过氧化物,进一步反应可生成氧脂素（oxylipins）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）等,从而参与调节生长发育、胁迫应答等过程。LOX是一个多基因家族,不同成员生理功能及参与的生物学过程不尽相同。然而,迄今还未详尽解析参与种子萌发过程的LOX家族成员及其表达调控机制。本文以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）为试材,全基因组鉴定LOX家族成员,定量分析棉花LOX基因在棉籽萌发时期表达特性谱以筛选参与种子萌发过程的候选LOX基因;克隆候选LOX基因及其启动子,分析启动子的顺式作用元件以预测调控候选LOX基因的转录因子;鉴定棉花WRKYⅠ亚家族成员,筛选参与种子萌发过程的WRKY成员并克隆候选WRKY基因编码序列;活体检测候选WRKY是否调控候选LOX基因的表达,以期深入揭示参与棉籽萌发过程调节的LOX成员的功能及其转录调控机制,为阐明棉花WRKY转录因子和LOX成员功能多样性,以及耐储棉花品种培育、种子萌发、幼苗形态建成调控和棉籽油品质改良提供新知识和科学参考。主要研究结果如下:1.参与棉籽萌发油脂降解的关键酶基因鉴定以拟南芥At LOX蛋白序列为索引序列,BLAST陆地棉基因组,共鉴定出22个Gh LOX家族成员,并根据基因在染色体位置上的命名,Gh LOX家族成员不均匀的分布于A和D亚组的15条染色体上。Gh LOX蛋白序列长度、等电点、相对分子量等理化性质根据其氨基酸数目等差异较大,但均具有相同的特征结构域及保守基序[His-（X）4-His-（X）4-His-（X）17-His-（X）8-His]。根据系统进化分析,Gh LOX基因分别属于9-Gh LOX、13-Gh LOX I和13-Gh LOX II三个亚家族。Gh LOX基因启动子预测表明,Gh LOX基因启动子存在不同功能和数目的顺式作用元件,例如W-box、MYB和MYC,预示着Gh LOX基因可能受WRKY、MYB、MYC等转录因子等调控。棉籽萌发时期亚油酸与亚麻酸降解模式与Gh LOX-A8.1、Gh LOX-A9、Gh LOX-D8.1、Gh LOX-D13的转录表达趋势一致,其中Gh LOX-D13的表达量最高,预示Gh LOX-D13基因在棉籽萌发油脂降解过程中发挥重要作用。2.调控棉花Gh LOX-D13基因的关键转录因子鉴定以拟南芥At WRKY I亚家族蛋白序列为探针,从棉花数据库中共鉴定出35条具有2个WRKY结构域和C2H2型锌指结构的Gh WRKY I亚家族蛋白序列,并依据ID排序进行命名。多序列比对结果表明,Gh WRKY I亚家族蛋白具有高度同源性。q RT-PCR检测Gh WRKY2、Gh WRKY24和Gh WRKY25基因在棉籽萌发72 h内的表达量持续上升,Gh WRKY21基因的表达量在48 h前呈上升趋势,48 h后开始下降。相关性分析表明,Gh LOX-D13与Gh WRKY24的相关性系数最高,r=-0.974,p=0.023,故此推测Gh WRKY24可能负调控Gh LOX-D13的表达。3.酵母单杂（Y1H）揭示转录因子Gh WRKY24结合Gh LOX-D13基因启动子分别克隆Gh WRKY24编码序列和含有W-box的Gh LOX-D13基因启动子序列,构建猎物载体p GADT7-Gh WRKY24及诱饵载体p Gh LOX-D13-Ab Ai。通过酵母单杂交鉴定Gh WRKY24转录因子是否能结合Gh LOX-D13的启动子。测试结果显示,Gh WRKY24转录因子可与Gh LOX-D13基因启动子区的W-box顺式作用元件相结合,从而调控Gh LOX-D13基因的转录表达。4.烟叶瞬时共表达35S::Gh WRKY24::GFP+pro Gh LOX-D13::GUS测试证明Gh WRKY24负调控Gh LOX-D13基因表达克隆Gh WRKY24编码序列构建35S::Gh WRKY24::GFP基因过表达载体,克隆Gh LOX-D13启动子并构建该基因启动子+GUS重组表达载体pro Gh LOX-D13::GUS,农杆菌介导在烟草叶片共表达35S::Gh WRKY24::GFP和pro Gh LOX-D13::GUS表达载体,检测GUS基因表达量及GUS酶活性。与仅表达pro Gh LOX-D13::GUS烟叶相比,共表达35S::Gh WRKY24::GFP和pro Gh LOX-D13::GUS的烟叶GUS显色较浅,GUS酶活性显著降低。证明Gh WRKY24转录因子能结合Gh LOX-D13启动子,负调控Gh LOX-D13基因表达。将35S::Gh WRKY24::GFP由农杆菌介导转入烟草叶片,转35S::GFP作为对照。取侵染的烟草叶片在荧光共聚焦显微镜下观察,发现过表达Gh WRKY24的烟草叶片中,绿色荧光蛋白只出现在细胞核中,证明Gh WRKY24转录因子定位于细胞核中。5.棉花子叶瞬时表达35S::Gh WRKY24::GFP测试证明Gh WRKY24负调控Gh LOX-D13基因表达农杆菌介导35S::Gh WRKY24::GFP在棉花子叶瞬时表达,转35S::GFP作为对照,检测棉花Gh LOX-D13基因表达量及油脂含量。结果显示,过表达Gh WRKY24的棉花子叶中Gh LOX-D13表达量仅为对照组的0.4倍,总脂肪酸含量上升1.08%,Gh LOX-D13的作用底物亚油酸和亚麻酸分别增加0.26%和0.20%,进一步证明了Gh WRKY24负调控Gh LOX-D13基因表达。综上所述,本研究鉴定获得参与棉籽萌发过程调节的脂氧合酶Gh LOX-D13基因和负调控其表达的转录因子Gh WRKY24。这些发现为深入解析种植老化、种子萌发过程及脂质氧化等生物学过程复杂协同调控机制和棉化油脂品质遗传改良提供了新见解。