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大豆（Glycine max）是世界主要粮油作物。提高大豆产量和抗逆性始终是大豆遗传育种的主攻任务。挖掘介导大豆油脂合成和逆境胁迫相应的转录因子有助于深入解析油脂合成和胁迫应答等生物学过程协同运作机制,并可为大豆油脂产量、品质和抗性遗传改良提供分子靶标。WIN1/SHN1（WAX INDUCER1/SHINE1）转录因子属于AP2/ERF（APETALA2/Ethylene-responsive factor）超家族ERF-B6亚家族成员。有关拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甘蓝型油菜（Brassica napus）和大麦（Hordeum vulgare）等植物WIN1的研究揭示WIN1参与植物蜡质合成调控和胁迫响应。然而,WIN1介导的调控网络及不同成员功能差异性还未详尽解析。本文从WIN1基因入手,系统分析大豆Gm WIN1基因家族成员及其生物学功能,特别是协同介导大豆油脂合成及逆境胁迫应答的分子机制。1.大豆Gm WIN1全基因鉴定及不同组织表达谱分析以拟南芥At WIN1蛋白序列为索引,在大豆基因组数据库中Blast比对,并结合大豆转录组数据,鉴定获得6个Gm WIN1转录因子,命名为Gm WIN1-1、Gm WIN1-2、Gm WIN1-3、Gm WIN1-4、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6。生物信息学分析发现,Gm WIN1均具有完整的开放阅读框（Open reading frame,ORF）和一个AP2保守功能域。q RTPCR检测显示,6个Gm WIN1基因在花器官中均有表达,其中Gm WIN1-3和Gm WIN1-5表达量最高,Gm WIN1-1和Gm WIN1-3在茎中也具有较高的表达,相对其它Gm WIN1基因Gm WIN1-5和Gm WIN1-6基因在种子1、种子2和种子3发育时期高量表达,且与种子油脂高量积累时期相吻合,预示着Gm WIN1-5和Gm WIN1-6可能参与种子油脂合成调控。2.转录因子Gm WIN1参与大豆幼苗的逆境胁迫响应对大豆幼苗分别进行干旱（20%PEG6000）、低温（4℃）、盐胁迫（200 m M Na Cl）处理。q RT-PCR结果显示,不同Gm WIN1成员参与不同胁迫响应。Gm WIN1-1、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6基因参与干旱胁迫响应,Gm WIN1-5和Gm WIN1-6基因参与盐胁迫响应,Gm WIN1-3和Gm WIN1-5基因参与低温胁迫响应。整合分析Gm WIN1在不同器官和三种逆境胁迫下的表达谱显示,Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6均高水平表达,推测其在大豆生长发育和逆境胁迫应答等生命过程可能行使重要作用。3.异源过表达Gm WIN1显著提高烟叶油脂积累和幼苗低温胁迫耐性分别克隆和构建三个重要的Gm WIN1基因（Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6）和组成型表达载体,农杆菌介导遗传转化普通烟草（Nicotiana tabacum）获得若干转基因烟草株系。转基因株系表型分析显示,与野生型烟草相比,低温胁迫下转基因株系烟叶总油脂含量显著增加7%-25%,然而,反应细胞膜脂氧化损伤的MDA含量显著降低24%-32%,幼苗胁迫损伤较少。显然,异源过表达Gm WIN1显著提高烟叶油脂积累和幼苗低温胁迫耐性。分别构建Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6与GFP融合蛋白表达载体,农杆菌介导在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达,亚细胞定位检测显示这三个Gm WIN1转录因子均定位于细胞核。4.过表达Gm WIN1显著促进大豆毛状根油脂积累和低温胁迫耐性以大豆品种‘Jack’为转化受体材料,发根农杆菌介导遗传转化,获得若干Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6分别过表达的转基因大豆毛状根系。转基因大豆毛状根系表型分析显示,与野生型毛状根相比,在低温胁迫下转基因大豆毛状根MDA含量显著减低18%-32%,总油脂积累显著上升16.5%-29%。这表明,表达Gm WIN1显著促进大豆毛状根油脂积累和低温胁迫耐性。5.过表达Gm WIN1导致脂质代谢通路相关基因表达显著改变进一步分析转Gm WIN1基因大豆毛状根相关内源基因表达谱发现,在分别过表达Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6大豆毛状根中,一组与脂肪酸和油脂合成相关的基因表达量发生明显变化。与野生型大豆毛状根相比,Gm WIN1过表达毛状根中Gm LPAT5-2,Gm BCCP1-4、Gm DGAT2-3和Gm PLD基因转录水平显著上调,表达量是野生型大豆毛状根中这些基因表达量的几倍到数十倍。然而,Gm WIN1过表达显著减低了参与油脂合成的Gm DGAT2-1酶基因转录水平,这与前人报道WIN1上调DGAT2基因表达不同。另一个新发现是Gm WIN1-5显著上调催化磷脂降解的Gm PLD酶基因表达。进一步构建Gm PLD酶基因启动子+GUS表达载体,并与转录因子Gm WIN1-5表达载体共同在烟草叶片瞬时表达,检测样品GUS活性显示,共表达两个载体的烟叶GUS酶活性是仅表达Gm PLD酶基因启动子+GUS载体的烟叶GUS酶活性的5倍,预示着Gm WIN1-5转录因子能与Gm PLD酶基因启动子结合,上调该酶基因的表达。本文鉴定并表征了介导大豆油脂合成及胁迫响应的重要Gm WIN1转录因子。Gm WIN1调控的下游基因包括Gm BCCP1-4、Gm DGAT2-1、Gm DGAT2-3、Gm LPAT5-2和Gm PLD。在低温胁迫下,Gm WIN1-3、Gm WIN1-5和Gm WIN1-6通过调控脂质代谢通路相关基因表达,促进不饱和油脂富集和细胞膜脂稳定性,赋予宿主逆境胁迫抗性。本研究揭示了WINI转录因子新功能,为大豆油脂及逆境抗性的遗传改良提供了新思路及相应的候选靶基因分子。