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前言 血管新生(Angiogenesis)是指通过内皮细胞的增殖和迁移，从先前存在的血管处以发芽或非发芽的形式形成新的毛细血管网的过程。一系列研究已证明，血管新生对于肿瘤的生长和转移有重要的意义。恶性血液病中也存在肿瘤血管新生的现象。肿瘤血管新生与一系列刺激内皮细胞增殖和毛细血管网生成的生长因子有关。 血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，现发现的VEGF成员有VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、VEGF-4及其受体VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2(flk-2／KDR)、VEGFR-3(flt-4)。VEGF家族的受体均为酪氨酸激酶受体。ras癌基因是早期发现的可以导致正常细胞发生恶性转化的癌基因之一。在哺乳动物中，ras癌基因有三个相似的家族成员H-ras、K-ras、N-ras。这三种癌基因的编码产物都是分子量为21,000的蛋白质，因此又称p21蛋白。在血液系统中以N-ras的表达为主。细胞外信号调节激酶(ERK)，有ERK1、ERK2两型。 为研究VEGF、N-Ras、pERK在恶性血液病中的表达及临床意义，我们研究了急性非淋巴细胞白血病(ANLL)初诊病例28例，完全缓解病例6例，急性淋巴细胞白血病(ALL)9例，慢性粒细胞白血病(CML)15例，其他恶性血液病6例，对照12例。应用免疫组织化学染色法检测其骨髓单个核细胞中VEGF、N-Ras、pERK蛋白的表达水平。目的旨在对白血病的各亚型及其他恶性血液病的VEGF、N-Ras、pERK蛋白的水平做一检测，以进一步探讨细胞因子VEGF与Ras／MAPK信号通路之间的内在联系，为探讨白血病的发病机理及为治疗提供新的靶点。实验材料与方法 一实验材料 1.药品与试剂:免疫组织化学试剂盒(北京中山试剂公司);一抗pERK(北京中山试剂公司);一抗N一Ras(博士德公司);一抗vEGF(博士德公司);淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司);DAB染色剂(北京中山试剂公司)。 2.实验仪器:细胞涂片离心机，低速离心机，光学显微镜。 二.实验方法 研究对象为ANLL初诊病例28例，ANLL完全缓解病例6例，ALLg例，CML15例，其他恶性血液病6例，对照12例。收集患者的骨髓液于事先加入肝素Inil并肝素化的注射器中。骨髓液经PBS稀释后，用FicoU密度梯度离心法提取单个核细胞。经镜下计数调整细胞悬液浓度后，细胞涂片离心机涂片。室温晾干后一40℃保存待测。标本自冷冻状态取出后，于室温孵育30min。免疫组织化学染色法检测VEGF、N一Ras、pERK蛋白在涂片细胞中的表达水平。于油镜下计数细胞100个，计算阳性细胞比例。采用SPsS .n .0统计处理软件进行统计学分析。实验结果 1.VEGF的表达 采用免疫组织化学染色法检测VEGF的表达水平。初诊ANLL、CML较对照组表达率高，t检验P值均小于0.05，有统计学显著差异。ALL、完全缓解ANLL与对照组t检验无统计学显著差异。初诊ANLL较完全缓解ANLL组表达率高，t检验P值小于0.05，有统计学显著差异。 2.N一Ras的表达 采用免疫组织化学染色法检测N一RaS蛋白的表达水平。初诊ANLL、CML较对照组表达率高，t检验P值均小于0.05，有统计学显著差异。完全缓解ANLL组较对照组表达率高，但t检验P值大于0 .05，无统计学显著差异。ALL组与对照组表达率t检验P值大于0.05，无统计学显著差异。初诊ANLL较完全缓解ANLL组表达率高，t检验P值小于0.05，有统计学显著差异。 3·pERK的表达 采用免疫组织化学染色法检测pERK蛋白的表达水平。初诊ANLL、CML较对照组表达率高，t检验P值均小于0.05，有统计学显著差异。完全缓解ANLL组与对照组表达率t检验无统计学显著差异。ALL较对照组表达率高，但t检验P值大于0.05，无统计学显著差异。初诊ANLL较完全缓解ANLL组表达率高，t检验P值小于0.05，有统计学显著差异。 4.VEGF、N一Ras、pERK相关性分析 VEGF、N一Ras、pERK两两相关有统计学意义，P值小于0.01。讨论 人类白血病是一种典型的由获得性染色体突变而引起的疾病。N一ras突变可导致造血祖细胞的增殖优势以及丧失分化功能。ras基因是由于突变而被活化继而成为一种与GTp相连的活化蛋白一GAP。Hitoshi对201例初诊ANLL患者进行了N一ras突变水平的检测，其中28例有N一ras突变，占13.93%。本研究应用N一Ras一抗为多克隆抗体，针对170一189氨基酸的人N一ras基因表达蛋白，在初诊ANLL中检出的表达率为59.75%。因N一ras作为一原癌基因只有在突变后才被活化，表达增加而未突变情况下表达水平极低，所以N一ras基因表达蛋白的多克隆抗体仍可反映出N-ras原癌基因突变后的活化水平。 MAPK/ERK可因ras基因突变被直接活化而在白血病分子发病机制中起重要作用。pERK为ERK的磷酸化形式也是活化形式。玩e以26例初诊ANLL患者为研究对象，用Westem印迹法和酶联免疫分析法分析了ERK的表达水平和活化程度。在ANLL中的ERK的表达水平和活化程度与正常骨髓进行统计学分析显示两者有显著差异。本实验结果与以上结论相同，ANLL初诊组较对照组pERK的表达水平高，统计学分析有显著差异，而ANLL完全缓解组与对