大丽轮枝菌是一种半活体营养植物致病真菌，能够在许多植物包括棉花上引起萎蔫病害，对农业生产造成巨大的危害。大丽轮枝菌的生命循环包括三个阶段：活体营养期、死体营养器和休眠期。大丽轮枝菌主要以微菌核这种休眠体结构在土壤中存活，当受到根营养刺激时就会萌发进入下一阶段的生命循环。本研究中，我们首先利用根癌农杆菌介导的遗传转化来构建了大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库，获得了许多表型改变尤其是微菌核的发育改变的突变体。进一步，我们通过本实验室建立的温室水培棉苗无伤接种鉴定大丽轮枝菌致病性的方法，鉴定了许多致病性改变的突变体，从而克隆了一些大丽轮枝菌的致病相关基因，进而研究其功能。对下面的几个致病相关基因的研究结果表明，利用根癌农杆菌介导的大丽轮枝菌的遗传转化构建的大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库结合我们建立的温室水培棉苗无伤接种鉴定大丽轮枝菌致病性的方法是一种在基因组范围内分析和鉴定大丽轮枝菌致病相关基因的有力工具。　　 我们首先对vdgarp1这个突变体进行了初步研究，发现一个编码富含谷氨酸残基蛋白的基因VdGARP1的突变导致了vdgarp1突变体致病性丧失，菌丝发育较发达，但微菌核发育延迟。基因VdGARP1的表达具有组织特异性，并且被不同的胁迫条件所诱导。此外，也能够在查氏培养基中被棉花提取物所激发。在极端营养缺陷型培养基上，微菌核的发育不需要基因VdGARP1的表达。我们的研究数据表明，VdGARP1基因是大丽轮枝菌侵染棉花及启始微菌核发育的重要因子。　　 我们研究的第二类基因是编码含有NPP1(necrosis-inducing Phytophthoraprotein1)结构域的效应子蛋白家族的基因。各种植物致病菌，包括细菌、真菌和卵菌能够分泌各种不同结构的效应子蛋白进入植物质外体和细胞质，从而建立侵染，抑制宿主的防御反应。大丽轮枝菌是一种半活体营养植物致病真菌。半活体营养致病菌在寄主体内繁殖时，需要从活体营养期转为死体营养期，从而通过诱导植物细胞的死亡来提供营养。基于基因组序列比对，我们从V592中鉴定了九个VdNLP基因，命名为VdNLP1～9。功能分析结果显示，仅有两个基因VdNLP1和VdNLP2编码的蛋白能够诱导烟草、拟南芥和棉花细胞的坏死以及防御反应。VdNLP1和VdNLP2蛋白都能够诱导棉花子叶的萎蔫，但是编码VdNLP1和VdNLP2蛋白的两个基因的单敲除和双敲除都没有影响大丽轮枝菌的致病性。我们也检测了其中七个基因的表达和诱导模式，发现恶劣营养坏境和棉花根部组织能够诱导它们的表达。通过比较VdNLPs保守的氨基酸，我们在VdNLP2的氨基酸序列上进行了一系列的点突变，从而鉴定了一些新的保守的氨基酸。除了两个半胱氨酸残基、D104氨基酸残基及一个保守的七肽基序‘GHRHDWE’，这些新的保守的氨基酸残基对于VdNLP2的诱导坏死活性也是必不可少的。　　 从突变体库中，我们也鉴定了另外一个VdSENP1(V.dahliae SUMO-specific protease1)基因T-DNA插入突变的突变体vdsenp1。VdSENP1基因编码的SUMO特异的蛋白酶，是蛋白质翻译后修饰SUMO化修饰途径中的关键酶。SUMO化修饰以多种方式调控着靶蛋白的功能，使细胞对周围环境变化做出应激反应。我们的研究结果显示，SUMO化修饰途径中的关键基因VdSENP1基因的突变及VdSUMO基因的敲除都减弱了大丽轮枝菌的致病性。SUMO化修饰在调控大丽轮枝菌的生长发育、冷胁迫耐性、微菌核的产生以及致病过程中起着重要的作用。为了研究SUMO化修饰对致病相关基因的调控，我们预测了约300多个大丽轮枝菌中SUMO化修饰的底物，并且正在通过酵母双杂交鉴定部分SUMO化修饰蛋白。通过双向电泳，我们还检测了野生型菌株V592和突变体vdsenp1之间蛋白表达的差异。综合SUMO化修饰底物的预测和双向电泳的结果，我们重点对可能的SUMO化修饰底物WD40重复蛋白编码基因VdPRO11和甘油醛-3-磷酸脱氢酶VdGAPDH两个基因进行了初步研究，发现基因VdPRO11的敲除导致突变体vdpro11产生了和突变体vdsenp1、vdsumo相似但是更严重的生长表型的异常，并且降低了致病性。VdPRO11和VdGAPDH蛋白的SUMO化修饰调控大丽轮枝菌生长发育和致病性的研究正在进行中。