研究背景：　　胰岛素抵抗（IR）在2型糖尿病和心血管病的发病机制中起到重要作用，改善IR是2型糖尿病患者治疗的一个主要目标。目前，现有的针对IR的药物（如二甲双胍和噻唑烷二酮类）并不能保持血糖在正常范围内，并且有显著的副作用。因此，从天然药物中寻找能改善胰岛素抵抗的药物，具有重要的临床意义。近年来提出了“糖尿病是糖脂病”的概念，使脂代谢紊乱与2型糖尿病发病机制的相关研究越来越得到重视。肝脏是调节血糖的重要脏器，肝脏 IR的主要表现是脂代谢紊乱。包括 FFA的输出增加，肝脏甘油三酯的含量增加及 LDL分泌增加，胰岛素抑制肝葡萄糖输出的效应减弱，最终导致肝糖原含量的下降，血糖升高。野马追提取物总黄酮为我课题组采用传统的水煎煮法加有机溶剂提取制得，经指纹图谱分析，主要成分为金丝桃苷、槲皮素和山柰素。本课题组前期研究发现，野马追提取物总黄酮可通过多途径、多靶点调节机体脂质代谢紊乱。大量研究表明，金丝桃苷、槲皮素和山柰素均能调节血糖和血脂的动态平衡，具有良好的降糖和改善胰岛素抵抗的作用。单味中药野马追提取物总黄酮（LEH）作为多种有效黄酮类化合物的混合物，对胰岛素抵抗的作用，目前尚无研究报道。因此本研究拟主要观察胰岛素抵抗肝细胞在胰岛素刺激后PI3K-Akt通路关键蛋白及GLUT2蛋白的表达，以及野马追提取物总黄酮治疗后上述蛋白表达的变化，从而探讨LEH改善胰岛素抵抗的作用的可能机制。　　研究目的：　　胰岛素受体底物IRS蛋白是胰岛素信号传导的基础，磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶 B通路是主要的传导途径，发生胰岛素抵抗时， PI3K-Akt通路关键蛋白（如IRS蛋白、PI3K蛋白、Akt蛋白、GLUT蛋白等）的表达均发生改变，通路活性降低。因此本研以2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠和IR-HepG2细胞为研究对象，野马追总黄酮为干预手段，重点观察在胰岛素抵抗状态下，PI3K-Akt通路关键蛋白 IRS-1、IRS-2、PI3K-p85、p-AktThr308、GLUT-2、PDX-1的表达，以及野马追总黄酮治疗后上述蛋白表达的变化，从而探讨野马追总黄酮改善胰岛素抵抗的作用及其机制。　　第一部分野马追提取物总黄酮的制备及质量控制：　　主要试验方法：　　分别采用大孔树脂法、有机溶剂提取法，制得野马追提取物1-5号，采取药效学筛选的办法，最终确定水煎煮后乙酸乙酯提取法。以提取液中的总黄酮为考察指标，再采用3因素，每因素3水平，用L9(33)正交试验进行实验，并采用直观分析法进行分析，以取得野马追总黄酮提取工艺优化条件。用HPLC法同时测定野马追提取物中金丝桃苷、槲皮素和山柰素含量，更全面地控制野马追提取物总黄酮的质量。　　主要研究结果：　　1.利用可见-紫外扫描仪确定野马追总黄酮的测定波长为510nm，确定了测定野马追总黄酮的方法。　　2.野马追总黄酮的最佳提取方法为水煎煮后乙酸乙酯提取法。提取最佳工艺参数为：采用水煎煮3次，加水量为药材量的12倍，第一次1.5小时，第二次、第三次各1小时。将滤液浓缩稠膏，加入硅藻土，混匀，干燥，粉碎成细粉，得颗粒。采用乙酸乙酯回流提取5次，每次回流1小时。滤过，浓缩既得。　　3.野马追总黄酮提取液中，分别含金丝桃苷0.0533 mg/ml，槲皮素0.0151 mg/ml、山柰素0.0215 mg/ml。以总黄酮计，总黄酮含量为0.0899mg/ml（1.7983mg/g生药）。　　第二部分2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型的建立与评价　　主要试验方法：　　将雄性SD大鼠喂以高脂高糖饲料8周，诱发出高血脂和胰岛素抵抗，继而给予35 mg/kg链脲佐菌素（STZ）一次性腹腔注射，导致胰岛素分泌障碍，诱发高血糖，建立实验性2型糖尿病大鼠模型。应用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术对模型动物进行胰岛素敏感性评价，以判断2型糖尿病胰岛素抵抗模型是否建立成功。　　主要研究结果：　　与普通饲料组相比，高脂高糖饲料组大鼠出现高血脂，STZ腹腔注射一周后，血糖明显增高，空腹血糖>7.8mmol/L，达到糖尿病的诊断标准。高脂高糖饲料+STZ组大鼠葡萄糖输注速度（GIR）胰岛素敏感性指数（ISI）显著降低，胰岛抵抗指数（HOMA-IR）显著升高，空腹血浆胰岛素显著升高，提示高脂高糖饲料+STZ组成功建立了2型糖尿病胰岛素抵抗模型。该模型具有高血糖、高血脂、伴有轻度胰岛β细胞受损，机体呈明显的胰岛素抵抗状态等特点，是研究2型糖尿病胰岛素抵抗相关疾病的理想模型。　　第三部分野马追提取物总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗敏感性与糖脂代谢的影响及其机制研究　　主要试验方法：　　1.建立2型糖尿病大鼠模型，给与野马追总黄酮灌胃6周治疗，并与吡格列酮治疗对比，观察其对胰岛素抵抗的改善作用及其对糖脂代谢的影响。　　2.应用 Western Blot技术检测2型糖尿病大鼠肝细胞 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308、t-Akt、PI3K-p85蛋白表达水平。　　3.应用 Western Blot技术检测2型糖尿病大鼠胰腺组织 PDX-1蛋白表达水平。　　主要研究结果：　　1．2型糖尿病胰岛素抵抗模型组大鼠 FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、FFAs水平较正常组均显著升高（P<0.05或P<0.01），GIR显著降低、ISI显著升高、HOMA-IR显著降低（P<0.05或P<0.01）。药物干预后，与模型组相比，野马追总黄酮可一定程度的降低模型组大鼠FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、FFAs水平，提高GIR，降低ISI，升高HOMA-IR（P<0.05或P<0.01），改善胰岛素抵抗。　　2．2型糖尿病胰岛素抵抗模型组大鼠肝组织中SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，肝糖原和肌糖原含量显著降低。野马追总黄酮可显著的升高肝组织中SOD活性，降低MDA含量，升高肝糖原和肌糖原含量。　　3．从病理切片观察2型糖尿病胰岛素抵抗模型组大鼠肝脏出现脂肪变性，野马追总黄酮可一定程度的减轻肝脏的脂变程度。　　4.2型糖尿病胰岛素抵抗模型组大鼠肝组织中 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表达水平较正常组均显著下降，同时PI3K-p85蛋白过度表达。野马追总黄酮可显著的升高肝组织中IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表达水平，同时抑制PI3K-p85蛋白的过度表达。　　5.2型糖尿病胰岛素抵抗模型组大鼠胰腺组织中PDX-1蛋白的表达水平显著下降，野马追总黄酮可显著的升高PDX-1蛋白的表达水平。　　第四部分野马追总黄酮提取液改善 HepG2细胞胰岛素抵抗作用及其机制研究　　主要试验方法：　　1.采用高胰岛素（1×10-6 mol/L）作用于 HepG2肝细胞，建立胰岛素抵抗的肝细胞模型。以吡格列酮为阳性对照药，评价野马追总黄酮对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响。　　2.应用 Western Blot技术检测 HepG2肝细胞 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308、t-Akt、PI3K-p85蛋白表达水平。　　3.运用免疫荧光染色技术，根据荧光所表达的部位和强度来判断待测目的蛋白在细胞内的定位以及用药干预后蛋白表达的变化。　　主要研究结果：　　1.胰岛素抵抗的肝细胞模型最佳造模胰岛素浓度为1×10-6 mol/L，最佳作用时间为48 h。予以胰岛素抵抗的肝细胞野马追总黄酮（0.50g生药/ml）处理，野马追总黄酮可以明显增加细胞葡萄糖的消耗量，改善IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗状态。　　2. IR-HepG2细胞中IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表达水平较正常组均显著下降，同时PI3K-p85蛋白过度表达。野马追总黄酮可显著的升高肝组织中 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表达水平，同时抑制PI3K-p85蛋白的过度表达。　　3.运用免疫荧光染色技术观察，结果表明：在 IR-HepG2细胞内GLUT2、phospho-AktThr308表达明显减少，PI3K-p85蛋白过度表达。经野马追总黄酮处理后，可以明显地看见细胞浆中的 GLUT2、phospho-AktThr308的表达增加，同时抑制PI3K-p85蛋白的过度表达。　　结论：　　动物实验和细胞实验均表明野马追总黄酮可以改善胰岛素抵抗状态，其作用机制均与野马追总黄酮改善PI3K/Akt信号通路转录活性，刺激IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表达水平，下调 PI3K-p85蛋白的过度表达有关。