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研究目的:1.在无菌条件下制备载有不同VEGF浓度的海藻酸盐/壳聚糖微球型支架。2.在体外分离培养HPMSCs。3.探究负载不同VEGF浓度的海藻酸盐/壳聚糖微球型支架对HPMSCs增殖和成骨活性的影响,探讨出促进HPMSCs增殖与成骨活性的最佳VEGF浓度,并且在此浓度下,来检测细胞与支架材料的黏附率。研究方法1.利用层层自组装和阴阳离子静电复合原理,制备载有VEGF和万古霉素的多层缓释微球型支架,并且对其中VEGF设置浓度梯度如下:无支架空白组;Ong/ml;10ng/ml;25ng/ml;50ng/ml。2.采用组织块培养法,从胎盘中分离培养出原代HPMSCs,利用三代以后的细胞进行成骨诱导分化和成脂诱导分化以及后续实验。3.通过MTT法检测不同浓度VEGF的微球型支架对HPMSCs的增殖活性的影响,通过成骨诱导茜素红染色、ALP染色、ALP活力测定和Western blot检测ALP和BMP-2基因表达情况来评价不同浓度VEGF的微球型支架对HPMSCs的成骨活性的影响。结果:1.无菌环境下制备的不同浓度VEGF的多层缓释微球支架兼具缓释和支架功能,形态良好。2.从胎盘组织中成功分离培养出长梭形的人胎盘源间充质干细胞,细胞经过成骨诱导后可见钙结节,成脂诱导后可见脂滴。3.支架材料中负载的高浓度的VEGF可以促进HPMSCs的增殖(P<0.05),支架材料中负载的VEGF可以促进HPMSCs的成骨分化,并且有剂量依赖性,当VEGF 50ng/ml时,细胞表现出最佳的增殖和成骨活性。结论:1.成功制备载有不同VEGF浓度的多层缓释微球型支架,并且验证其无菌。2.成功从胎盘组织中提取出HPMSCs,成骨诱导和成脂诱导鉴定其符合干细胞特征。3.通过支架材料与HPMSCs的共培养,探讨出了促进HPMSCs增殖与成骨活性的最佳VEGF浓度为50ng/ml。4.本实验构建了以HPMSCs为种子细胞,以海藻酸钠/壳聚糖微球型支架为支架材料,以VEGF为细胞因子,万古霉素为抗炎药物的组织工程骨,为后续体内实验提供理论基础。