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鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是从八角莲的根茎中提取的有效活性成分。近年来研究发现鬼臼毒素及其衍生物具有较强的抗肿瘤活性。本实验室将鬼臼毒素单体进行相应的化学结构改造,得到一系列鬼臼毒素衍生物,经活性筛选发现其中YB-1EPN在体外有较强的抗肿瘤活性,尤其是对多药耐药细胞株有显著的抑制作用,且具有良好的量效关系。目的:本文研究YB-1EPN对多药耐药细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法:1 MTT法和SRB法检测YB-1EPN的抗肿瘤活性。用96孔培养板接种对数生长期的多药耐药肿瘤细胞(K562/A02、KBV200)、多种敏感的人源性肿瘤细胞和人的血管内皮细胞(VEC)及成纤维细胞(fb),培养24h后,加入不同浓度YB-1EPN(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L),96h后以MTT法和SRB法测定YB-1EPN在体外对各种肿瘤细胞及正常细胞的IC50或GI50值。2荧光显微镜观察YB-1EPN作用后肿瘤细胞形态结构改变。在处于对数生长期KBV200细胞中加入不同浓度YB-1EPN,作用24h后进行Giemsa染色和Hoechst33342/PI双染色,以紫外光(340nm)激发Hoechst/PI,荧光显微镜观察照相并保留结果。3琼脂糖凝胶电泳分析YB-1EPN对KBV200细胞染色体DNA断裂的影响。在对数生长期KBV200细胞中加入不同浓度YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L),作用24h后抽提样本DNA,于1.5%琼脂糖胶电泳,电泳完成后用紫外光下观察并照相。VP-16(10μmol/L)作用组为阳性对照组。4流式细胞术分析YB-1EPN对KBV200细胞周期及凋亡率的影响。对数生长期KBV200细胞中加入不同浓度YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L),分别作用12h、24h后用流式细胞仪检测其对KBV200细胞的影响。5 RT-PCR法检测不同浓度YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)对KBV200细胞mdr-1、p53、bcl-2、bax、p21、caspase-3 mRNA表达的影响。6 YB-1EPN对微管的影响.7免疫组化法观察不同浓度YB-1EPN对K562/A02细胞P-gp蛋白表达的影响。8 Western-blot法检测不同浓度YB-1EPN对KBV200细胞P-gp蛋白表达的影响。9建立S180肿瘤获得性多药耐药模型采用临床上常用的PFC联合化疗方案:(1)顺铂,3mg/kg,每周ip给药一次:(2)环磷酰胺,5-FU,各3mg/kg,每日ig1次,连续给药10周。免疫组化法检测细胞p-gp的表达情况。10观察YB-1EPN对动物移植性肿瘤的抑制作用。昆明鼠右腋下移植实体型耐药S180肉瘤,接种耐药S180肉瘤24h后,连续腹腔注射YB-1EPN(7.14mg/kg/d、11.42mg/kg/d)7d,于第8 d处死动物,剥离肿瘤并称重,观察YB-1EPN对耐药型实体S180肉瘤的治疗作用。11观察YB-1EPN对腹水型S180昆明小鼠生命延长作用。昆明小鼠腹腔接种腹水型S180肉瘤,次日开始连续灌胃(32mg/kg/d、64mg/kg/d)7天,观察YB-1EPN对腹水型S180生命延长作用。结果1 YB-1EPN的体外抗肿瘤作用在体外通过MTT和SRB方法发现YB-1EPN对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用, IC50为1.330μmol/L～9.06μmol/L;而且对多药耐药肿瘤细胞也有较好的活性,其对K562/A02和KBV200的GI50分别为4.714μmol/L和2.5234μmol/L。MTT结果显示,在体外,YB-1EPN对癌细胞与正常细胞具有较好的选择性,对人的正常血管内皮细胞(VEC)和成纤维细胞(fb)的IC50均>50μmol/L。通过对KBV200和K562/AO2细胞生长曲线的观察,发现YB-1EPN对多药耐药肿瘤细胞的生长抑制作用随着给药剂量的增加而增强。YB-1EPN的抗肿瘤活性高于阳性对照依托泊苷(vp-16),同时还具有显著的抗多药耐药肿瘤细胞的活性。2 YB-1EPN的体内抗肿瘤作用分别连续腹腔注射YB-1EPN ( 7.14mg/kg/d、11.42mg/kg/d)7d,观察其对小鼠耐药实体型肉瘤S180的生长抑制率分别为56.16%和61.49%,大、小剂量组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.01),且各剂量组小鼠体重与对照组无显著性差异(P>0.05)。说明YB-1EPN在体内试验表现出良好的肿瘤抑制作用,且无明显毒副作用。3 YB-1EPN对耐药腹水型小鼠生命延长作用。昆明小鼠腹腔接种腹水型S180肉瘤,次日开始灌胃(32mg/kg/d和64mg/kg/d)连续7d,观察YB-1EPN对小鼠生命延长作用。低剂量组和高剂量组的生命延长率分别为16.5%和55.95%,高剂量和对照组相比有显著的差异(P<0.01),低剂量与对照组有显著性差异(p<0.05)。说明YB-1EPN在高剂量时对S180腹水型昆明小鼠有较好的延长生存时间的作用。4 YB-1EPN对多药耐药肿瘤细胞(KBV200)周期的影响本实验采用流式细胞仪分析了YB-1EPN对KBV200细胞周期移行的影响。经不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)分别作用于KBV200细胞12h、24h后,细胞各时相均有抑制,且12h细胞周期被阻断在G2+M期,而24h细胞周期被阻断在G1期。这说明YB-1EPN作用12h后,药物进入细胞核内,细胞被阻滞在DNA合成期;而作用24h后,细胞在DNA合成前就被阻滞。5 YB-1EPN诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡YB-1EPN能够诱导KBV200细胞凋亡,不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于KBV200细胞24h后,用荧光染料Hoechst 33342/PI对细胞进行染色,在紫外光(340nm)激发下发出蓝色荧光,而坏死的细胞则被激发出红色的荧光。荧光显微镜下观察发现YB-1EPN可使细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,并且随着给药浓度的加大,镜下这种细胞形态的变化愈来愈明显,表明凋亡细胞的比例逐渐增加。在DNA凝胶电泳实验中,用不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于KBV200细胞24h,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现“DNA梯子”(DNA ladder)。流式细胞仪进行细胞的DNA含量测定,可见不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L和2μmol/L)作用于KBV200细胞12h后,即开始出现细胞凋亡,且凋亡细胞的比例随着YB-1EPN浓度的升高和作用时间的延长而增加,呈剂量与时间依赖性。以上结果显示YB-1EPN能够诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡。6 YB-1EPN对细胞微管形态的影响不同浓度的YB-1EPN1(1～4μM)作用于KBV200细胞12h后,通过微管免疫荧光法观察YB-1EPN对微管形态的影响,可见对照组的KBV200细胞,微管形态结构完整,个别单根微管的轮廓亦可清晰辨认;而1μM YB-1EPN处理后微管结构受到一定程度的破坏,数量减少、断片增多;4μM的YB-1EPN则使绝大部分微管结构破坏,微管不再成束,仅在核周残留少量点状不规则荧光。阳性对照药VP-16(10μM)处理后的细胞微管不再成束,断裂成片断,呈点状不规则荧光,与YB-1EPN处理后的细胞微管形态变化相似。而紫杉醇(0.01μM)处理后的细胞微管呈三个或多个区域聚集分布,与紫杉醇抑制微管解聚的作用相一致。由此可见,YB-1EPN可能通过抑制微管蛋白聚合,影响肿瘤细胞纺锤体形成,来抑制细胞有丝分裂。7 YB-1EPN对KBV200多药耐药性基因mdr-1、凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21、caspase-3表达及mdr-1编码的蛋白P-gp表达的影响本实验观察了YB-1EPN对mdr-1基因及凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21和caspase-3的mRNA表达的影响。经不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于KBV200细胞24小时,RT-PCR结果显示YB-1EPN可增加p53、p21、caspase3及bax的mRNA表达,同时降低了bcl-2和mdr-1mRNA的表达,结果同对照组相比均有显著性差异(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。提示YB-1EPN诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调了p53、p21、caspase-3以及Bax的mRNA表达,同时协同下调抑制凋亡基因Bcl-2和多药耐药性基因mdr-1 mRNA的表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。经不同浓度的YB-1EPN(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于K562/AO2细胞24h,免疫组化结果显示YB-1EPN可使K562/AO2细胞P-gp蛋白的表达量降低,且呈一定的剂量依赖性。同时western-blot结果显示YB-1EPN同样降低KBV200细胞p-gp的表达。结论: YB-1EPN在体外能够抑制多种人源性肿瘤细胞及多种多药耐药肿瘤细胞的生长。在体内,YB-1EPN对于耐药型小鼠移植性肿瘤有较好的抑制作用,并且能够显著延长耐药腹水型S180小鼠的生存期限。通过依赖p53途径,上调p21、caspase-3及bax基因表达,同时下调bcl-2基因的表达诱导多药耐药细胞凋亡;下调mdr-1及其产物P-gp蛋白的表达从而部分逆转多药耐药细胞的耐药性;阻滞多药耐药肿瘤细胞在G2+M期或G1期,抑制细胞微管聚合,影响纺锤体形成来阻止细胞有丝分裂,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。因此,YB-1EPN有望成为一个有自主知识产权,低毒性的新型抗肿瘤化合物。