研究背景多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病,是青年人最常见的进行性神经系统疾病之一。尽管MS具体病因不清,但研究表明其与自身免疫系统过度激活密切相关。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS病理生理机制及药物治疗的常用动物模型。目前治疗MS的疾病修饰药物(disease-modifying drug,DMD),主要是延缓疾病进展、降低患者复发风险,治疗效果不甚理想,故仍需要进一步寻找其他治疗方法。研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)除了细胞再生能力以外,还具有免疫调节及抗炎功能。脐带组织及骨髓组织来源的MSCs,可以改善EAE动物临床评分,减轻炎症反应及白细胞浸润。另外,脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchyma Stem Cells,UCMSCs)已经用于MS患者临床治疗实验阶段,结果表明,UCMSCs移植后患者症状明显改善,移植过程中无临床发作,扩展残疾状况评分量表(expanded disability status scale,EDSS)得分下降,MRI 显示病灶数量减少。因此,MSCs移植是治疗EAE/MS非常有潜力的方法。MSCs介导的免疫调节机制十分复杂。研究表明人类组织来源的 MSCs 可以利用吲哚胺 2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenease,IDO1)发挥免疫调节作用,而MSCs中IDO1的表达发生在接触γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)后,因此我们推测MSCs中IDO1的表达与IFN-y密切相关。那IFN-y诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)后,细胞中 IDO1 的表达会发生什么样的变化?IFN-γ-hUCMSCs是否对EAE小鼠有治疗作用?具体机制是什么?依据上述研究背景,本研究首先应用不同浓度及时间的IFN-γ对hUCMSCs进行诱导,检测细胞中 IDO1 的表达情况;再用IFN-γ-hUCMSCs移植治疗EAE小鼠,观察与hUCMSCs移植治疗相比,IFN-γ-hUCMSCs移植后,EAE小鼠的临床表现及行为学评分、肌电图改变、炎症因子浓度变化等,并初步探讨IFN-γ-hUCMSCs移植对EAE小鼠的治疗作用以及可能的免疫学机制。研究目的1.观察 IFN-γ对hUCMSCs的诱导作用。首先分离、培养hUCMSCs,并鉴定其分化潜能,后用不同浓度及时间的IFN-γ诱导处理hUCMSCs,观察IDO1表达,分析其表达是否与IFN-γ浓度及诱导时间相关;2.观察IFN-γ-hUCMSCs对EAE小鼠的治疗作用。选取合适浓度及诱导时间的IFN-γ-hUCMSCs,尾静脉注射移植治疗EAE小鼠,观察小鼠的体重、神经功能评分、肌电图改变、炎症因子浓度变化;3.初步探讨IFN-γ-hUCMSCs对EAE小鼠的治疗作用及可能的免疫学机制。研究方法1.hUCMSCs的分离、培养及鉴定:取健康足月剖宫产胎儿脐带组织,分离得到hUCMSCs并传代扩增,检测其向成骨细胞和脂肪细胞的分化能力,流式细胞术检测 hUCMSCs的表面标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105 及 HLA-DR;2.为明确 IFN-γ对hUCMSCs的诱导作用,分别用不同浓度(20ng/ml、50ng/ml)的IFN-y诱导hUCMSCs,观察不同诱导时间(24h、48h、72h)后,hUCMSCs 细胞中 IDO1 表达情况;RT-PCR及Western blot方法分别检测不同条件下的 IFN-γ诱导后,hUCMSCs中IDO1的mRNA、蛋白表达情况,比较不同浓度及不同诱导时间的IFN-γ诱导后,hUCMSCs内的IDO1表达是否有差异,并选择合适诱导条件下的IFN-γ-hUCMSCs,用于EAE小鼠的移植治疗;3.为观察IFN-γ-hUCMSCs对EAE小鼠的治疗作用,进行了分组、EAE建模、细胞移植治疗及临床评价。选取6-8周龄的C57BL/6J雌鼠,适应性饲养1周后随机分成4组,用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55 免疫诱导建立EAE小鼠模型,治疗组分别予以hUCMSCs、IFN-γ-hUCMSCs尾静脉注射,对照组小鼠予以等体积的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)尾静脉注射,空白对照组小鼠未进行免疫诱导、尾静脉注射等体积的PBS。观察各组小鼠体重、临床症状及行为学评分、肌电图检测小鼠神经脱髓鞘程度;4.为检测IFN-γ-hUCMSCs移植治疗EAE小鼠后,小鼠体内炎症反应情况,用ELISA方法检测了各组小鼠血清中IL-17A、TNF-α浓度,以及脾脏巨噬细胞上清液中IL-10、IL-17A浓度;5.为进一步探究可能的免疫机制,用RT-PCR方法检测STA T3,ROR-γt及Foxp3基因的mRNA表达,分析各组表达情况并进行统计学分析,探究可能的免疫学机制。研究结果1.hUCMSCs的分离与培养将hUCMSCs置于细胞培液中进行培养,原代培养第4天时,可见有少量梭形或三角形细胞贴壁生长。hUCMSCs的扩增周期约为3天,每周更换细胞培养液2次。当贴壁细胞的生长密度达到70-80%以上时进行传代培养。细胞传代到第四代时,将细胞取出并进行免疫表型鉴定。培养的hUCMSCs纯度在95%以上,显微镜观察发现,贴壁细胞呈成纤维细胞样形态。结果显示,我们分离培养的hUCMSCs生长良好,适合后续实验研究。2.hUCMSCs的免疫表型鉴定流式细胞学结果显示,细胞表面的CD73、CD90、CD105表达都在 95%以上,呈高表达;而 CD11b、CD19、CD34、CD45 和 HLA-DR表达都低于3%,呈低表达或不表达。免疫表型结果表明,我们培养的细胞为hUCMSCs,适合用于后续的实验研究。3.hUCMSCs分化潜能的鉴定3.1 hUCMSCs向成骨细胞分化hUCMSCs在特定条件下可以分化为成骨细胞。在倒置显微镜下可以看到hUCMSCs分化成的成骨细胞,被茜素红染为棕红色。3.2 hUCMSCs向脂肪细胞分化hUCMSCs在特定条件下可以分化为脂肪细胞。在倒置显微镜下可以看到hUCMSCs分化成为脂肪细胞,可被油红O染为红色。以上结果表明,我们分离培养的hUCMSCs具有良好的分化潜能。4.IFN-γ诱导hUCMSCs细胞中的IDO1 mRNA表达上调为了研究IFN-γ诱导hUCMSCs后,细胞中IDO1的表达情况,我们将hUCMSCs细胞分别放入含不同浓度的 IFN-γ(20ng/ml,50ng/ml)细胞培养液中,诱导不同时间(24h、48h、72h)后收集,应用RT-PCR检测hUCMSCs细胞中IDO1 mRNA的表达情况。与对照组相比,IFN-γ诱导能明显提高hUCMSCs细胞IDO1 mRNA表达量,并且表达量与IFN-y浓度及诱导时间均呈正相关,随着IFN-y浓度升高、诱导时间延长,IDO1 mRNA表达逐渐增加。我们研究结果表明,IFN-y可以诱导hUCMSCs细胞中IDO1的mRNA表达上调。5.IFN-y诱导hUCMSCs细胞中的IDO1蛋白表达增加为进一步研究IFN-γ对hUCMSCs细胞中IDO1蛋白表达的影响,我们应用Western blot方法检测各组中IDO1蛋白表达情况。结果显示,IDO1蛋白表达与mRNA一致,与对照组相比,IFN-γ能明显提高hUCMSCs细胞中的IDO1蛋白表达,与IFN-γ浓度及诱导时间呈正相关,随着IFN-γ浓度升高、诱导时间延长,IDO1蛋白表达呈逐渐增加趋势。进一步对 Western blot结果进行定量分析发现,IFN-y(20ng/ml,48h)组及 IFN-y(20ng/ml,72h)组的 IDO1 蛋白表达明显高于IFN-γ(20ng/ml,24h)组,有明显统计学差异;但是IFN-y(20ng/ml,48h)组和 IFN-y(20ng/ml,72h)组,以及 IFN-y(20ng/ml,48h)和 IFN-γ(50ng/ml,48h)组的 IDO1 蛋白表达无统计学差异。研究结果表明,IFN-γ可以诱导hUCMSCs细胞中IDO1的蛋白表达增加。结合RT-PCR和Western blot结果,我们发现经IFN-y诱导后,hUCMSCs细胞中的IDO1表达明显上调,且呈现时间-剂量相关性。另外,我们发现同等浓度IFN-γ诱导条件下,诱导时间48h组和72h组的IDO1蛋白表达明显高于24h组,但是48h组和72h组之间差异不明显;同样诱导时间为48h时,20ng/ml浓度组和50ng/ml浓度组,IDO1蛋白表达也没有统计学差异;因此,我们选择了 IFN-y(20ng/ml,48h)条件诱导的hUCMSCs细胞,用于后续动物实验研究,观察IFN-γ-hUCMSCs对EAE小鼠的治疗作用。6.EAE小鼠建模MOG35-55免疫诱导6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠,小鼠普遍在免疫后的第14天左右发病,表现为体型消瘦,尾巴张力减低或消失,逐渐出现步态笨拙,共济失调,肢体无力及尿便失禁等。7.IFN-γ-hUCMSCs移植治疗可以缓解EAE小鼠的体重减轻及临床症状在EAE小鼠发病初期,即免疫后的第 14天,分别进行hUCMSCs和IFN-γ-hUCMSCs细胞尾静脉移植治疗,对照组小鼠予以等量PBS尾静脉注射,每日监测小鼠体重及行为学评分。我们发现未治疗的EAE小鼠体重呈逐渐下降趋势,且临床症状逐渐加重,行为学评分逐渐上升;而hUCMSCs和IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗组,EAE小鼠体重减轻变缓,后逐渐出现体重上升;临床症状逐渐减轻,行为学评分逐渐下降,IFN-y-hUCMSCs细胞移植治疗组小鼠的体重减轻更加缓慢,后逐渐出现体重上升,临床症状也更轻,行为学评分更低。我们研究结果表明,与 hUCMSCs 移植治疗相比,IFN-γ-hUCMSCs移植治疗可以更加显著减轻EAE小鼠体重的下降及临床症状的加重,改善EAE小鼠病情。8.IFN--γ-hUCMSCs移植治疗可以减轻EAE小鼠脱髓鞘程度EAE小鼠免疫后的第28d,即细胞移植后第14天,我们进行了肌电图检测。采用单通道刺激器进行了电刺激实验,刺激电极放置在小鼠运动皮层,银针电极穿过皮肤,然后到达肌腹,记录运动诱发电位(motor evoked potentials,MEP)潜伏期。EAE小鼠肌肉明显萎缩,复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅不能反映神经损伤的真实状态,因此,我们检测MEP潜伏期,以反映小鼠神经脱髓鞘的程度。我们发现与空白对照组小鼠相比较,EAE小鼠动作电位潜伏期明显延长,证明EAE小鼠存在脱髓鞘病变,建模成立;与未治疗的EAE小鼠相比,予以hUCMSCs和IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗后,小鼠的动作电位潜伏期明显缩短,且IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗组更显著。我们的研究结果表明,与hUCMSCs移植治疗相比,IFN-y-hUCMSCs移植治疗可以更加明显地改善EAE小鼠脱髓鞘程度。9.IFN-γ-hUCMSCs移植治疗可以减轻EAE小鼠体内炎症反应为明确小鼠体内炎症反应情况,我们检测了小鼠外周血内的炎症因子IL-17A、TNF-α水平,以及小鼠脾脏巨噬细胞培养液中的炎症因子IL-10、IL-17A的水平。我们研究发现,与空白对照组小鼠相比,EAE小鼠外周血中的促炎因子(IL-17A和TNF-α)浓度明显升高,提示EAE小鼠体内有明显的炎症反应;予以hUCMSCs和IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗后,EAE小鼠外周血中的IL-17A和TNF-α水平明显下降,且IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗组的促炎因子下降更加显著。另外,我们还检测了小鼠脾脏巨噬细胞培养液中的IL-10、IL-17A的水平。我们发现与空白对照组小鼠相比,EAE小鼠的IL-10浓度降低,而IL-17A浓度明显升高;经hUCMSCs和IFN--γ-hUCMSCs细胞移植治疗后,抑炎因子IL-10浓度明显升高,而促炎因子IL-17A浓度则明显下降,且IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗组效果更加显著。EAE小鼠外周血及脾脏巨噬细胞培养液中相关炎症因子检测结果表明,与hUCMSCs细胞移植治疗相比,IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗可以更加明显地提高抑炎因子的浓度,并且降低促炎因子的浓度,从而减轻EAE小鼠体内炎症反应。10.IFN-γ-hUCMSCs移植可能通过STAT3/ROR-γt/Foxp3信号通路减轻EAE小鼠体内炎症反应我们应用RT-PCR技术检测小鼠腰髓组织中的STA T3、ROR-γt及Foxp3的mRNA表达,发现与空白对照组相比,EAE小鼠腰髓组织中的STA T3及ROR-γt的mRNA表达增加,而Foxp3的mRNA表达减少。hUCMSCs和IFN-γ-hUCMSCs细胞移植治疗后,EAE小鼠的STAT3及ROR-γt的mRNA的表达显著减少,但Foxp3的mRNA表达上调,且IFN-γ-hUCMSCs移植治疗组比hUCMSCs移植治疗组显 著。我 们 推 测 IFN-γ-hUCMSCs 移 植 可 能 通 过STA T3/R OR-γt/Foxp3信号通路,调节Th 17细胞/Tregs细胞失衡,减轻炎症反应。结论1.IFN-γ诱导hUCMSCs后,可以明显提高细胞中IDO 1 mRNA及蛋白的表达,并且表达增加,呈时间-剂量相关性;2.IFN-γ-hUCMSCs可以明显改善EAE小鼠的临床症状,减轻炎症反应及脱髓鞘程度;3.IFN-γ-hUCMSCs 通过 STA T3/ROR-yt/Foxp3信号通路,调节Th17细胞/Tregs细胞失衡,从而减轻EAE小鼠的炎症反应,为可能的免疫学机制。意义该研究明确了 IFN-γ诱导处理可以增加hUCMSCs细胞中ID01的表达,IFN-γ-hUCMSCs可以明显改善EAE小鼠临床症状中,并从神经免疫方面探索其治疗机制,为IFN-γ-hUCMSCs在MS中的治疗提供重要依据。