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目的:白内障作为一种常见的衰老相关疾病,发病率迅速上升。一直以来,白内障发病机制不明确已成为其非手术治疗研究的瓶颈,以往有关白内障发病机制的研究,达成共识的是晶状体上皮细胞凋亡是非先天性白内障形成的共同细胞学基础。在白内障患者中,其前房及晶状体内活性氧的含量明显高于正常人。体外研究证实,相当于白内障患者晶状体内的过氧化氢可导致晶状体上皮细胞凋亡和晶状体混浊,此变化类似于白内障患者眼内的病理表现。小泛素相关修饰物（small ubiquitin related modifier,SUMO）修饰是与泛素化类似的蛋白翻译后修饰形式,在哺乳动物中SUMO家族主要有4个蛋白亚型:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。在正常情况下,SUMO主要是以非活性前体的形式存在,SUMO修饰就是SUMO共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基的蛋白质翻译后修饰。晶状体上皮源性生长因子（PC4 and SFRS1 interacting protein 1,PSIP1）是一种新发现的细胞存活因子,已报道PSIP1在调节各种细胞功能中发挥作用,PSIP1在眼细胞抗应激损伤过程中亦起到重要作用。在晶状体、视网膜、角膜、脉络膜等组织中均可检测到PSIP1的表达,也参与晶状体上皮细胞向纤维细胞分化。本研究首次发现SUMO修饰PSIP1在晶状体上皮细胞对抗氧化应激压力中的重要作用,并进一步探讨其相关机制。方法:利用体外培养人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）。建立人晶状体上皮细胞氧化应激模型:利用不同浓度H2O2处理SRA01/04细胞,H2O2浓度分别为100μM,200μM,400μM,800μM和1m M,于37℃,5%CO2及充分饱和湿度的培养箱内处理1h。采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测细胞内源性活性氧（ROS）水平,MTS测定细胞增殖活力,实时定量聚合酶链反应（RT-q PCR）、Western blot、免疫细胞化学染色检测SRA01/04中SUMO1、PSIP1的表达情况及与氧化应激组的差异性表达。免疫共沉淀检测SRA01/04中PSIP1的SUMO1修饰,构建p EGFP-PS IP1真核表达载体,定点突变获得SUMO结合位点突变的PS IP1真核表达载体,构建p GL3Hsp27luc载体,利用脂质体方法转染及共转染质粒进入细胞过表达相应蛋白,双荧光素酶报告基因检测系统检测PSIP1的转录活性。应用SPSS18.0统计分析软件进行统计学分析。数据以均值±标准差表示,进行ANOVA方差分析及独立样本t检验,P<0.05为有统计学意义。结果:1、氧化应激对人晶状体上皮细胞内源性ROS、细胞增值活性、PCNA水平的影响。随着H2O2浓度的升高,细胞内ROS呈逐渐升高趋势（P<0.001）,细胞增殖活性呈逐渐减低趋势（P<0.001）,PCNA表达量逐渐减少。表明过氧化氢引起细胞氧化应激,降低人晶状体上皮细胞增殖活性,引起细胞凋亡。2、氧化应激对人晶状体上皮细胞中SUMO1和PSIP1表达及SUMO化的影响。与对照组相比,在m RNA水平和蛋白水平H2O2处理组SUMO1与PSIP1表达均显著升高（P<0.001）,Western blot显示随着H2O2浓度的升高,PSIP1表达逐渐增加,游离SUMO1逐渐减少,H2O2处理组SUMO1结合蛋白增加。结果表明在人晶状体上皮细胞中SUMO1和PSIP1表达水平在氧化应激条件下均升高,且总体SUMO1修饰增加。3、生理状态下人晶状体上皮细胞中PSIP1可被SUMO修饰。生理状态下人晶状体上皮细胞中内源性的PSIP1可被SUMO修饰,且内源性的PSIP1在生理状态下为单SUMO1修饰。4、p EGFP-PSIP1真核表达载体的构建及表达鉴定。双酶切分析显示,重组质粒被切出约1605bp的片段,与预期目的片断大小相符。测序结果表明合成的PISP1基因序列正确与预期一致,开放读码框正确,无突变。将p EGF-PSIP1转染入人晶状体上皮细胞中,结果显示24h后转染p EGFP-PSIP1细胞表达绿色荧光,与对照组相比转染p EGFP-PSIP1组m RNA水平PS IP1表达显著升高（P<0.001）,蛋白水平PS IP1表达亦显著升高,证实构建的p EGFP-PSIP1真核表达载体能良好的在人晶状体上皮细胞中过表达融合蛋白EGFP-PSIP1。5、氧化应激条件下人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO1修饰的变化。采用PS IP1抗体免疫沉淀后,用SUMO1抗体进行免疫印迹,结果表明氧化应激减少人晶状体上皮细胞内PSIP1的SUMO化。6、SUMO修饰位点突变的PSIP1真核表达载体的构建及表达检测。选取预测PSIP1蛋白的SUMO修饰位点分值最高的第364位的赖氨酸（K）,利用定点突变技术将PSIP1的K364突变为精氨酸（R）,并构建SUMO修饰位点突变的PSIP1真核表达载体（p EGFP-K364R）。经双酶切和测序结果表明合成的PSIP1基因序列正确与预期一致,开放读码框正确,无非预期的突变。分别转染p EGFP-PSIP1和p EGFP-K364R进入人晶状体上皮细胞,24h后转染p EGFP-PSIP1组和p EGFP-K364R组细胞均表达绿色荧光,Western blot结果显示转染p EGFP-PSIP1组和p EGFP-K364R组均检处p EGFP-PS IP1/p EGFP-K364R条带,表明本研究中构建的p EGFP-K364R真核表达载体能良好的在人晶状体上皮细胞中过表达SUMO位点突变的PSIP1。7、PS IP1的SUMO结合位点鉴定。为明确K364是否为PSIP1的SUMO结合位点,分别共转染p EGFP-SUMO1和p EGFP-PSIP1,p EGFP-SUMO1和p EGFP-K364R进入人晶状体上皮细胞,24h后荧光显微镜观察两组细胞均表达绿色荧光,48h后利用免疫共沉淀技术,显示共转染p EGFP-SUMO1和p EGFP-K364R组未检出p EGFP-SUMO1-p EGFP-PSIP1,表明在人晶状体上皮细胞内SUMO修饰位点突变的PSIP1不与SUMO结合,K364确为PSIP1的SUMO修饰位点。8、人晶状体上皮细胞中SUMO化/去SUMO化对PSIP1的转录活性的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染p GL3Hsp27luc,p RL-TK,p EGFP-PSIP1或K364R,进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,与对照组相比野生型PSIP1的表达升高其对Hsp27启动子的转录活性（P<0.001）,SUMO修饰位点突变的PSIP1的表达升高其对Hsp27启动子的转录活性（P<0.001）,与野生型PSIP1相比SUMO化位点突变的PSIP1升高对Hsp27启动子的转录活性（P<0.05）。结果表明在人晶状体上皮细胞中去SUMO化升高PSIP1的转录活性。9、人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO化/去SUMO化对PS IP1的下游因子的影响。western检测Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达水平结果显示,与对照组（p EGFP-C1）相比野生型PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高,与对照组相比SUMO修饰位点突变的PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高,与野生型PSIP1相比SUMO化位点突变的PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高。10、PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞增殖活性的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染野生型PSIP1,SUMO化位点突变的PSIP1（p EGFP-K364R）或p EGFP-C1,转染48h后,采用MTS比色法检测细胞活性。结果显示,与对照组相比转染野生型PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与对照组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与野生型PSIP1组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,结果表明PSIP1的去SUMO化增加人晶状体上皮细胞的增殖活性。11、PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞对抗氧化应激能力的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染野生型PSIP1,SUMO化位点突变的PSIP1（p EGFP-K364R）或p EGFP-C1。H2O2处理后与对照组相比转染野生型PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与对照组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与野生型PSIP1组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.05）,结果表明PSIP1的去SUMO化升高人晶状体上皮细胞对抗氧化应激的能力。结论:人晶状体上皮细胞中PSIP1在生理状态下持续被SUMO1修饰,氧化应激发生时激活PSIP1去SUMO化,从而提高PSIP1转录活性,上调其下游转录因子Hsp27等应激相关基因的表达,从而保护细胞对抗氧化应激,维持细胞存活,以对抗白内障的发生。