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脑卒中具有发病率高、死亡率高、致残率高、且病理生理学机理复杂的特点。因此，寻找脑卒中治疗的新策略和新靶点具有重要的科学意义和临床价值。化学遗传学是指利用遗传学原理，以化学小分子通过干扰/过表达调节生理过程中特定蛋白质功能的新兴学科。目前，化学遗传学已被证明是一种有价值的研究工具，成为医学研究的热点。相关研究表明，刺激运动皮层可能会促进脑卒中的康复，但是相关的机制目前尚不明确，在本文中，我们将利用病毒转染使大鼠运动皮层表达hM3d（Gq），并结合腹腔注射N-氧化氯氮平（CNO），进而特异性激活运动皮层中的谷氨酸能神经元，探讨运动皮层的谷氨酸能神经元在脑梗死大鼠的恢复过程中的作用及可能机制。本论文将开展如下三部分的研究：
第一部分 脑梗塞大鼠模型的制备
目的 建立脑梗塞大鼠模型，并对模型的稳定性、成功率进行评价。
方法 （1）MCAO脑梗塞大鼠模型的建立：取40只体重为200-250 g的SD大鼠，随机分为MCAO模型组和假手术组，每组20只大鼠。所有大鼠经戊巴比妥麻醉后，右侧颈部正中线旁开2 mm，切开颈部皮肤，将右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分离，在颈总动脉距离颈内外动脉分叉3-5 mm处，将线栓穿入颈内动脉，穿入深度距分叉处18-20毫米，结扎右侧颈外动脉。假手术组大鼠不进行线栓结扎处理。（2）MCAO模型评价：手术处理后2小时和24小时，分别评定MCAO组和假手术组大鼠的神经缺失情况，用Longa评分法进行。手术24小时后，收集MCAO模型组和假手术组大鼠脑组织，进行TTC染色，测量脑梗塞组织体积。
结果 （1）手术2小时后MCAO模型组大鼠的存活率为80%，假手术组大鼠的存活率为100%；手术24小时后 MCAO模型组大鼠的存活率为70%，假手术组大鼠的存活率为100%。（2）术后2小时进行神经缺失评分。MCAO模型组中神经缺失评分为1-3分的大鼠占70%；手术24小时后MCAO模型组中神经缺失评分为1-3分的大鼠占65%。（3）TTC染色表明手术24小时后MCAO模型组大鼠产生大面积的梗死灶，脑梗死体积为38.62±3.28%。
结论 通过线栓法建立的MCAO大鼠脑梗塞模型具有模型成功率高、大鼠存活率高、脑梗死范围相对固定、组内差异小的特点，是开展脑梗死相关研究的良好模型。
第二部分 化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠运动和认知功能的影响
目的 本部分研究将阐明化学遗传学技术对运动皮层谷氨酸能神经元的激活作用，并进而探究化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠运动功能和认知功能的影响。
方法（1）本部分研究分为以下三组：pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry+MCAO+CNO 组 （ 实 验 组 ） 、 pAAV2/9-CaMKII α -hM3D(Gq)-mCherry+MCAO+vehicle （ DMSO+生理盐水）组（对照组 1 ）和 pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry+MCAO+CNO 组（对照组2）。在MCAO大鼠模型建立4周前，利用脑立体定位技术向大鼠双侧运动皮层M1区分别注射pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry （实验组和对照组1）和pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry病毒（对照组2 ）。共 110 只成年大鼠注射 pAAV2/9-CaMKIIα -hM3D(Gq)-mCherry ， 50只成年大鼠注射pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry。另外取10 只乳鼠（出生 15-17 天）注射 pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry。病毒注射后4周利用线栓法建立MCAO大鼠模型，并在建模后24小时分别腹腔注射CNO （实验组和对照组2 ）和生理盐水（对照组1），连续注射10天。（2）病毒注射4周后，处死大鼠，收集大鼠脑组织制作脑片，利用荧光显微镜观察大鼠大脑运动皮层中mcherry的表达情况，利用免疫荧光染色检测CaMKIIα阳性谷氨酸能神经元细胞的病毒表达情况。（3）病毒注射14-16天后，用膜片钳技术检测乳鼠大脑运动皮层的电生理功能。（ 4 ） MCAO大鼠神经功能、运动功能和认知功能评定：CNO连续腹腔注射10天后停止，于24 h后（MCAO手术后第12天）利用Longa神经缺失量表评定大鼠神经功能；利用grip test和悬吊实验评定大鼠运动功能；MCAO手术后第12天利用水迷宫实验评定大鼠认知功能。
结果（1）病毒表达情况:病毒注射4周后，荧光显微镜激光激发后显示，运动皮层M1区出现红色荧光，表明病毒注在运动皮层表达。进一步的免疫荧光染色结果显示运动皮层M1区谷氨酸能神经元细胞中同时表达CaMKIIα和红色荧光蛋白，表明pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry进入了谷氨酸能神经元，并表达。（2）病毒的电生理功能：病毒注射 14-16 后，膜片钳检测表明表达 hM3D(Gq)-mCherry神经元的代表性电压在CNO应用之后出现明显的上升， CNO撤掉之后，电压回落，降到基线水平，说明CNO能够化学激活谷氨酸能神经元，并引起谷氨酸能神经元兴奋。（3）MCAO大鼠神经功能、运动功能、和认知功能评定： Longa神经缺失量表评定结果表明实验组的神经功能缺损评分显著低于对照组 1 和对照组 2 （ P=0.021,P=0.016 ） ， 但 对 照 组 1 和 2 之 间 差 异 不 显 著（P=0.813）； grip test结果显示，实验组的握力测试分数显著高于对照组（均P＜0.001），对照组之间无显著差异（P=0.815）；悬吊实验显示，与对照组相比，实验组悬吊时间显著延长（均P＜0.001），对照组之间也无显著差异（P=0.622）；；水迷宫实验结果表明实验组逃避潜伏期低于对照组（P＜0.05），游泳速度明显快于对照组（P＜0.05）；在探查试验中，将平台移除，实验组与两个对照组大鼠在目标象限中花费的时间有显著性差异（P=0.032, P=0.009），对照组之间无显著差异（ P=0.547 ）；对位训练中，实验组与两个对照组比较，大鼠穿越平台位置数量显著增加（P=0.024，P=0.012），对照组之间穿越平台位置数量上无显著差异（P=0.735）。
结论: 脑立体定位注射腺相关病毒pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry联合腹腔注射CNO能够化学激活谷氨酸能神经元，并引起谷氨酸能神经元兴奋。化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元可促进MCAO后整体神经状态、运动功能、协调性和耐力的恢复，进而促进脑梗塞所导致的大鼠空间学习和记忆损害的恢复。
第三部分 化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元促进脑梗塞大鼠运动和认知功能恢复的相关机制
目的：观察化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠脑组织中炎症因子、血管生成因子表以达及对脑梗塞大鼠脑组织白质纤维的影响，并探讨相关机制。
方法：第2部分水迷宫测试结束以后， hM3D(Gq)+CNO组存活26只大鼠、hM3D(Gq)+载体（ vehicle ）组22只， mCherry+CNO组22只存活。从三组中各随机抽取一半数量的大鼠进行炎性因子检测和脑白质电镜观察。收集以上各组大鼠的左脑和右脑海马组织，提取组织总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后，利用基因液相芯片技术检测各组大鼠的左右脑海马组织中炎症因子TNF-α、IL-18、IL-10和血管生成因子VEGF的表达情况；收集hM3D(Gq)+CNO组、hM3D(Gq)+载体（ vehicle ）组和mCherry+CNO组大鼠的左脑和右脑脑白质组织，经固定、脱水、球切法包埋组织后利用扫描技术对脑组织中白质纤维的厚度和排列情况进行检测。
结果：（1）MCAO处理导致大鼠海马组织中促炎类因子TNF-α和IL-18 的表达升高（ p＜0.01 ） ，抑制抑炎类因子 IL-10 的表达（p＜0.01）；（2）运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活能特异性抑制MCAO所导致的脑组织中TNF-α和IL-18的表达升高（p＜0.01）；（ 3 ）运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活促进MCAO大鼠脑组织中IL-10的表达（p＜0.01）；（4）MCAO处理导致大鼠海马组织中血管生成因子VEGF表达升高（p＞0.05），但运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活对 MCAO 大鼠脑组织中 VEGF 的表达无显著调控作用（p＞0.05）；（5）MCAO大鼠出现了髓鞘变薄、多层髓鞘和脱髓鞘的情况，并伴随有轴索的萎缩；（6）运动皮层谷氨酸能神经元趋化激活的MCAO大鼠中髓神经纤维的髓鞘增厚，且排列密集、整齐。
结论：运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活可通过抑制TNF-α、IL-18表达和促进IL-10表达来抑制脑炎症，进而有效缓解MCAO后大鼠的白质纤维损伤。
第一部分 脑梗塞大鼠模型的制备
目的 建立脑梗塞大鼠模型，并对模型的稳定性、成功率进行评价。
方法 （1）MCAO脑梗塞大鼠模型的建立：取40只体重为200-250 g的SD大鼠，随机分为MCAO模型组和假手术组，每组20只大鼠。所有大鼠经戊巴比妥麻醉后，右侧颈部正中线旁开2 mm，切开颈部皮肤，将右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分离，在颈总动脉距离颈内外动脉分叉3-5 mm处，将线栓穿入颈内动脉，穿入深度距分叉处18-20毫米，结扎右侧颈外动脉。假手术组大鼠不进行线栓结扎处理。（2）MCAO模型评价：手术处理后2小时和24小时，分别评定MCAO组和假手术组大鼠的神经缺失情况，用Longa评分法进行。手术24小时后，收集MCAO模型组和假手术组大鼠脑组织，进行TTC染色，测量脑梗塞组织体积。
结果 （1）手术2小时后MCAO模型组大鼠的存活率为80%，假手术组大鼠的存活率为100%；手术24小时后 MCAO模型组大鼠的存活率为70%，假手术组大鼠的存活率为100%。（2）术后2小时进行神经缺失评分。MCAO模型组中神经缺失评分为1-3分的大鼠占70%；手术24小时后MCAO模型组中神经缺失评分为1-3分的大鼠占65%。（3）TTC染色表明手术24小时后MCAO模型组大鼠产生大面积的梗死灶，脑梗死体积为38.62±3.28%。
结论 通过线栓法建立的MCAO大鼠脑梗塞模型具有模型成功率高、大鼠存活率高、脑梗死范围相对固定、组内差异小的特点，是开展脑梗死相关研究的良好模型。
第二部分 化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠运动和认知功能的影响
目的 本部分研究将阐明化学遗传学技术对运动皮层谷氨酸能神经元的激活作用，并进而探究化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠运动功能和认知功能的影响。
方法（1）本部分研究分为以下三组：pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry+MCAO+CNO 组 （ 实 验 组 ） 、 pAAV2/9-CaMKII α -hM3D(Gq)-mCherry+MCAO+vehicle （ DMSO+生理盐水）组（对照组 1 ）和 pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry+MCAO+CNO 组（对照组2）。在MCAO大鼠模型建立4周前，利用脑立体定位技术向大鼠双侧运动皮层M1区分别注射pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry （实验组和对照组1）和pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry病毒（对照组2 ）。共 110 只成年大鼠注射 pAAV2/9-CaMKIIα -hM3D(Gq)-mCherry ， 50只成年大鼠注射pAAV2/9-CaMKIIα-mcherry。另外取10 只乳鼠（出生 15-17 天）注射 pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry。病毒注射后4周利用线栓法建立MCAO大鼠模型，并在建模后24小时分别腹腔注射CNO （实验组和对照组2 ）和生理盐水（对照组1），连续注射10天。（2）病毒注射4周后，处死大鼠，收集大鼠脑组织制作脑片，利用荧光显微镜观察大鼠大脑运动皮层中mcherry的表达情况，利用免疫荧光染色检测CaMKIIα阳性谷氨酸能神经元细胞的病毒表达情况。（3）病毒注射14-16天后，用膜片钳技术检测乳鼠大脑运动皮层的电生理功能。（ 4 ） MCAO大鼠神经功能、运动功能和认知功能评定：CNO连续腹腔注射10天后停止，于24 h后（MCAO手术后第12天）利用Longa神经缺失量表评定大鼠神经功能；利用grip test和悬吊实验评定大鼠运动功能；MCAO手术后第12天利用水迷宫实验评定大鼠认知功能。
结果（1）病毒表达情况:病毒注射4周后，荧光显微镜激光激发后显示，运动皮层M1区出现红色荧光，表明病毒注在运动皮层表达。进一步的免疫荧光染色结果显示运动皮层M1区谷氨酸能神经元细胞中同时表达CaMKIIα和红色荧光蛋白，表明pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry进入了谷氨酸能神经元，并表达。（2）病毒的电生理功能：病毒注射 14-16 后，膜片钳检测表明表达 hM3D(Gq)-mCherry神经元的代表性电压在CNO应用之后出现明显的上升， CNO撤掉之后，电压回落，降到基线水平，说明CNO能够化学激活谷氨酸能神经元，并引起谷氨酸能神经元兴奋。（3）MCAO大鼠神经功能、运动功能、和认知功能评定： Longa神经缺失量表评定结果表明实验组的神经功能缺损评分显著低于对照组 1 和对照组 2 （ P=0.021,P=0.016 ） ， 但 对 照 组 1 和 2 之 间 差 异 不 显 著（P=0.813）； grip test结果显示，实验组的握力测试分数显著高于对照组（均P＜0.001），对照组之间无显著差异（P=0.815）；悬吊实验显示，与对照组相比，实验组悬吊时间显著延长（均P＜0.001），对照组之间也无显著差异（P=0.622）；；水迷宫实验结果表明实验组逃避潜伏期低于对照组（P＜0.05），游泳速度明显快于对照组（P＜0.05）；在探查试验中，将平台移除，实验组与两个对照组大鼠在目标象限中花费的时间有显著性差异（P=0.032, P=0.009），对照组之间无显著差异（ P=0.547 ）；对位训练中，实验组与两个对照组比较，大鼠穿越平台位置数量显著增加（P=0.024，P=0.012），对照组之间穿越平台位置数量上无显著差异（P=0.735）。
结论: 脑立体定位注射腺相关病毒pAAV2/9-CaMKIIα-hM3D(Gq)-mCherry联合腹腔注射CNO能够化学激活谷氨酸能神经元，并引起谷氨酸能神经元兴奋。化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元可促进MCAO后整体神经状态、运动功能、协调性和耐力的恢复，进而促进脑梗塞所导致的大鼠空间学习和记忆损害的恢复。
第三部分 化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元促进脑梗塞大鼠运动和认知功能恢复的相关机制
目的：观察化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑梗塞大鼠脑组织中炎症因子、血管生成因子表以达及对脑梗塞大鼠脑组织白质纤维的影响，并探讨相关机制。
方法：第2部分水迷宫测试结束以后， hM3D(Gq)+CNO组存活26只大鼠、hM3D(Gq)+载体（ vehicle ）组22只， mCherry+CNO组22只存活。从三组中各随机抽取一半数量的大鼠进行炎性因子检测和脑白质电镜观察。收集以上各组大鼠的左脑和右脑海马组织，提取组织总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后，利用基因液相芯片技术检测各组大鼠的左右脑海马组织中炎症因子TNF-α、IL-18、IL-10和血管生成因子VEGF的表达情况；收集hM3D(Gq)+CNO组、hM3D(Gq)+载体（ vehicle ）组和mCherry+CNO组大鼠的左脑和右脑脑白质组织，经固定、脱水、球切法包埋组织后利用扫描技术对脑组织中白质纤维的厚度和排列情况进行检测。
结果：（1）MCAO处理导致大鼠海马组织中促炎类因子TNF-α和IL-18 的表达升高（ p＜0.01 ） ，抑制抑炎类因子 IL-10 的表达（p＜0.01）；（2）运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活能特异性抑制MCAO所导致的脑组织中TNF-α和IL-18的表达升高（p＜0.01）；（ 3 ）运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活促进MCAO大鼠脑组织中IL-10的表达（p＜0.01）；（4）MCAO处理导致大鼠海马组织中血管生成因子VEGF表达升高（p＞0.05），但运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活对 MCAO 大鼠脑组织中 VEGF 的表达无显著调控作用（p＞0.05）；（5）MCAO大鼠出现了髓鞘变薄、多层髓鞘和脱髓鞘的情况，并伴随有轴索的萎缩；（6）运动皮层谷氨酸能神经元趋化激活的MCAO大鼠中髓神经纤维的髓鞘增厚，且排列密集、整齐。
结论：运动皮层谷氨酸能神经元的趋化激活可通过抑制TNF-α、IL-18表达和促进IL-10表达来抑制脑炎症，进而有效缓解MCAO后大鼠的白质纤维损伤。