癌症是一种最常见的恶性肿瘤。近年来的研究表明,脂质代谢广泛存在于细胞生长、增殖、分化、生存、膜稳态等多种细胞过程,与正常细胞相比,大多数癌细胞表现出异常的脂质代谢,该过程为癌细胞提供了大分子构件、信号脂质分子、蛋白质翻译后修饰和支持细胞快速增殖和生存的能量供应。干扰脂质代谢有望成为一种有前景的靶向抗癌策略。德氮吡格（Tetrazanbigen,TNBG）是本课题组前期原创研制的通过干扰脂代谢发挥抗肿瘤作用的化合物。其分子中刚性较强,通过对其结构中的氮原子上增加侧链改造（增柔作用）,增加了立体结构的空间柔性和分子极性,改善了水溶性,获得了TNBG02（又名:TNBG-5602）,同时又保持了经干扰脂代谢发挥的抗肿瘤活性。经研究显示TNBG02具有类似于TNBG的抗肿瘤活性,是理想的抗肿瘤创新候选物。本文旨在建立TNBG02在生物样品中的定量方法,探讨TNBG02在生物体内的药代动力学参数及组织分布,进行其生物转化过程的研究,说明TNBG02与CYP450中典型代谢酶亚型相互作用的特点。阐明了药代动力学的规律,并进行了生物学评价。1.采用UPLC-MS/MS的高通量分析方法,成功建立了生物样品的分析方法。该分析方法基于超高效液相平台和超细填料色谱柱分离技术保证,其的特点是,第一,样品前处理简单,采用有机溶剂沉淀法,处理的样品速度快。第二,分析速度快,柱效和灵敏度高。TNBG02和IS保留时间分别为约2.7min和2.4min,分离度好（大于1.5）,理论塔板数高,不低于10000。试验结果表明,在大鼠给药前后血浆样品和组织中,TNBG02与IS（内标物）能有效分离,峰型尖锐对称。在选定色谱条件下,内源性物质对测定无干扰,残留效应低;日内、日间精密度及准确度等各项验证指标均可满足生物样品分析要求。TNBG02在血浆样品中,在2.78 ng/m L～556.8 ng/m L浓度范围内具有良好线性,相关系数r均不低于0.999,在定量下限2.784 ng/m L浓度水平,连续进样（n=6）,TNBG02的信噪比均不低于10,精密度RSD小于10%,灵敏度高,可满足药动学研究测定要求;TNBG02在组织样品测定中,选择性好,在1.37 ng/m L～2192 ng/m L浓度范围内具有良好线性,相关系数r均不低于0.999,在定量下限2.558 ng/m L浓度水平,连续进样（n=6）,TNBG02的信噪比均不低于10,精密度RSD小于10%,灵敏度高,可满足组织分布研究测定要求;以上各项验证结果均符合生物样品定量分析相关要求。该方法适用于TNBG02药代动力学研究生物样品的分析测定。2.采用了UPLC-MS/MS方法,成功进行了大鼠体内的药代动力学和组织分布的研究。2.1.静脉给药的TNBG02的“血药浓度-时间曲线”研究:大鼠单次静脉给药后的血药浓度曲线表明,TNBG02在大鼠体内能快速分布及清除;根据Phoenix Win Nonlin（Version8.3,Certara）药代动力学分析软件拟合结果,获得药动学参数为:消除半衰期(t1/2β)为710.9min;表观清除率（CL）为0.022 L/min,外周室表观分布容积为13.2L,中央室至外周室表观清除速率为外周室至中央室清除速率的1.5倍,这表明外周室作为TNBG02的药物储库,对TNBG02的体内分布有重要作用。2.2.静脉给药后大鼠组织体内分布的研究:大鼠体内组织分布研究结果证明,其在体内各组织器官中能快速分布,给药后10min即可在主要器官中分布达到峰值,并能被快速清除,24h仅肺中能检出少量TNBG02,其他组织中均未检出原药,这表明其组织内蓄积量极低,产生蓄积毒性的可能性较低;在大鼠心、肺、脾、肾、肝、胃和脑等主要器官中均有分布,并能通过血脑屏障。2.3.TNBG02的血浆蛋白结合率的研究,实验结果显示,TNBG02在1μg/m L、5μg/m L和10μg/m L的大鼠血浆蛋白结合率（n=3）分别为79.8%、83.1%和78.2%,各浓度结合率无显著差异,即TNBG02的血浆蛋白结合率与浓度无显著相关性。3.采用UPLC-Q-TOF-MS分析技术对TNBG02的生物转化进行研究。3.1.采用UPLC-Q-TOF-MS分析技术和SCIEXOS（Version 2.1）代谢物分析平台,首次对大鼠单次尾静脉注射给药后（1 mg/只）的尿液及粪便中获得TNBG02的代谢物进行快速分析和鉴定。共计15个代谢产物被找到,包括获得一级和二级结构的代谢产物13个,只获得一级结构的代谢产物2个。成功推导出TNBG02的多条体内代谢途径,发现TNBG02代谢物经肾脏及肝脏排泄途径不完全相同,其中经尿液排出的代谢物的主要代谢途径为羟基化、N-去甲基化等,尿液中发现的主要代谢物有5个,即分别为M1、M2、M3、M4和M5;粪便中代谢物的主要代谢途径为羟基化、N-去甲基化、侧链氧化同时刚性共平面环羟基化,粪便中发现的主要代谢物有7个,即分别为M1、M2、M3、M5、M10、M11、M12,次要代谢途径有N-去甲基后重排、侧链氧化、双羟基化等,次要代谢物有M4、M6、M7、M8及M13;M1～M5为粪便及尿液共有的代谢物,M6～M15为粪便中特有的代谢物。3.2.通过体外单一人工重组酶的孵育降解实验证明了体内生物转化和单一酶的关系。在4种人重组酶孵育体系中,采用UPLC-MS/MS技术,成功检出TNBG02代谢物共计6个,其共同代谢物为M5。其中经CYP2D6酶系代谢物有6种:分别为m/z376.21（M1、M2、M3、M4）、m/z346.20（M5）和m/z392.20（M13）;经CYP3A4酶系代谢物有1种,为（M5:m/z346.20）;经CYP4V2酶系代谢物有1种（M5:m/z346.20）;经CYP2C9酶系代谢物1种（M5:m/z346.20）。并且发现CYP2D6亚型在TNBG02的代谢过程中起主要作用,主要代谢途径为CYP2D6介导的羟基化及N-去甲基化,主要代谢位点为侧链胺基及TNBG母核刚性共平面性环结构中的A环或E环。4.定性和定量研究了CYP450酶与TNBG02相互作用关系。4.1.不同种属肝微粒体的代谢作用研究。经不同种属肝微粒体的酶动学实验结果显示,TNBG02可经CYPs酶系统进行代谢,并具有较大种属差异,人、大鼠和犬的肝微粒体对TNBG02的代谢催化作用依次为:人＞大鼠＞犬,其中人肝微粒体对TNBG02的代谢反应有明显催化作用,在NADPH启动反应的孵育体系中,TNBG02的体外代谢半衰期约为155min,这表明人肝微粒体能显著催化TNBG02的代谢反应。4.2.人肝微粒体中混合氧化酶的作用强度研究,采用特异性底物的UPLC-MS/MS定量分析方法,经人肝微粒体与TNBG02体外的相互作用研究结果表明,TNBG02对经CYP2D6代谢的特异性探针药物的代谢有竞争性抑制作用。4.3.通过单组分人工重组酶的孵育的酶代动力学研究并测得TNBG02对CYP2D6、CYP2C9和CYP3A4等酶系亚型的IC50值,发现TNBG02对CYP2D6有较强抑制作用,其IC50值为2.52μM,对CYP2C9及CYP3A4略有抑制作用,其IC50值分别为9.63μM和18.74μM。进一步说明CYP2D6在TNBG02与人肝微粒体的相互作用过程中起了关键作用。5.通过计算机模拟技术,建立TNBG02与代谢酶的相互作用模型。从分子结构层面上研究TNBG02与代谢酶之间相互作用的机制,讨论TNBG02的侧链的改造对化合物与酶作用的影响。同时以TNBG结构为对照研究,对接了可以参与生物转化的酶CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8和CYP2C19。发现了与TNBG02代谢的关键酶为CYP2D6（PDB code:4XRY）,它通过ASP301残基与TNBG02侧链上的NH通过氢键产生相互作用,距离为2.74（?）,证明TNBG02与CYP2D6有特异性结合作用,这与体内外酶代谢实验结果一致。同时TNBG02的侧链N原子能够分别与CYP450酶亚型CYP1A2,CYP2C8,CYP2C19三种蛋白的相应氨基酸残基形成一个氢键,而先导化合物TNBG则只能通过骨架上的N原子与酶CYP1A2和CYP2C19形成一个氢键,这表明目标分子TNBG02与这些CYP450酶亚型目标靶蛋白的相互作用更强,即同等情况下,目标分子TNBG02由于侧链的引入增强了与CYP450酶亚型目标靶蛋白的相互作用通过对比研究TNBG与TNBG02结构上的差异和与酶相互作用的差异,证明TNBG02的侧链的改造不仅对理化性质有重要影响,同时该侧链对其在生物体内转化的过程非常关键。综上所述,经对抗癌药物TNBG02在大鼠体内通过静脉给药后有快速广泛的组织分布和清除,产生药物体内蓄积的可能性低。房室模型拟合后显示出体内的二房室分布特征,外周室作为TNBG02的药物储库,对TNBG02的体内分布有重要作用。TNBG02代谢物存在经肾脏、肝脏等多种排泄途径,能够被CYP450酶系代谢,其中代谢的主要酶系为CYP2D6（PDB code:4XRY）亚型,CYP2D6代谢酶通过ASP301残基与TNBG02侧链上的NH通过氢键与TNBG02产生特异性结合主要代谢位点为侧链胺基及TNBG母核刚性共平面结构中的A环和E环,主要代谢物为羟基化及N-去甲基化产物。人肝微粒体能显著催化TNBG02的代谢反应,与其他两个种属有明显差异;CYP2D6在TNBG02与人肝微粒体的相互作用过程中起了关键作用;通过TNBG02与TNBG对比研究,证明侧链结构改造不仅对理化性质有重要影响,同时对其生物转化过程有重要影响。