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背景及目的: 食管癌是人类消化系统常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织2012年统计显示,食管癌居全部恶性肿瘤第8位,死亡率居第9位。我国是食管癌的高发国家, 2012 年的统计数据显示,食管癌发病率居我国各类恶性肿瘤第 6 位,死亡率居第4位,是严重威胁我国人民生命与健康的恶性肿瘤。我国目前食管癌患者的疗效仍不理想:临床上确诊的食管癌患者约半数已进入中晚期,术后5年生存率仅25%左右,非手术患者预后更差。目前临床迫切需要解决包括早期诊断,新型高效特异性抗食管癌药物的开发及对肿瘤细胞的多重耐药与肿瘤干细胞的处理等一系列问题。但是,作为解决上述问题的前提与基础,目前对食管癌的基础研究相对滞后,食管癌发生、发展、转移、耐药等一系列过程的分子机制还远未阐明。FOXO3最早是在肿瘤研究过程中作为抑癌基因被发现,随后的研究发现,FOXOs除了对肿瘤的调控作用外,还广泛参与细胞的凋亡、增殖、分化、DNA损伤修复、应激反应、能量代谢及衰老等一系列重要的生命过程。因此,本研究以抑癌基因FOXO3为切入点,对其在食管癌细胞的增殖与凋亡过程中的调控作用及分子机制进行研究,以期为抗食管癌药物筛选提供新靶点或为临床诊断、预后判断提供依据。 材料和方法: 1.用含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素/100U/mL链霉素的高糖DMEM培养基培养人食管鳞癌细胞系TE1与TE13及正常人食管上皮细胞HEEpiC。 2. 首先采用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹(Western blotting)技术检测并比较人食管鳞癌细胞TE1、TE13与正常食管上皮细胞HEEpiC间FOXO3表达水平的差异,以初步判断其与食管癌发生的关系。 3. 然后使用AMPK激活剂AICAR处理三种细胞72小时,在24小时、48小时和72小时三个不同时间点通过CCK8法绘制细胞生长曲线,观察细胞增殖及活度的变化,通过免疫荧光染色技术观察处理前及处理后FOXO3蛋白的细胞内定位以判断其活性的变化。 4. 采用PI染色方法通过流式细胞技术比较AMPK激活后TE1细胞、TE13细胞及HEEpiC细胞的细胞周期与增殖的变化。 5. 采用免疫印迹技术(Western blotting)检测AICAR处理前后AMPK(Thr172)与FOXO3(Ser413)位点磷酸化水平及其下游细胞周期调控相关靶蛋白如p21Cip、p27Kip、CyclinD1、CyclinG2的表达水平及pRb磷酸化水平的变化。 6. 采用免疫印迹技术( Western blotting )检测 AICAR 处理前后AKT(Ser473/Thr308) 位点及FOXO3(Ser253)位点磷酸化水平的变化,以判断AICAR处理对PI3K/AKT/FOXO3通路活性的影响。 7. 采用免疫印迹技术(Western blotting)检测AICAR处理前后mTORC的主要组成成分Rictor及抑癌基因PTEN的表达水平的变化。 结果: 1. 在人食管鳞癌细胞系TE1、TE13及人正常食管上皮细胞HEEpiC中,FOXO3在HEEpiC细胞中的表达水平最高,在TE1与TE13两种食管鳞状细胞癌细胞系中的表达明显降低,且在高分化的TE13细胞中的表达要高于低分化的TE1细胞。 2. AICAR处理TE1、TE13与HEEpiC细胞,显著抑制了三种细胞的增殖,同时诱导食管鳞癌细胞TE1与TE3出现S期停滞,而对人食管上皮细胞HEEpiC的细胞周期并无明显影响。 3. AICAR处理使TE1、TE13与HEEpiC细胞内的AMPK Thr172位点磷酸化水平及作为其下游靶点的FOXO3 Ser413位点的磷酸化水平均明显升高,且FOXO3的亚细胞定位从细胞质转入细胞核。 4. AICAR处理活化了AMPK/FOXO3通路,与细胞周期变化相一致,转录因子FOXO3下游包括p21、p27、p53、cyclinG2等细胞周期调控相关的靶蛋白的水平在HEEpiC细胞中也均随处理时间延长而升高,在TE1细胞中则降低,TE13细胞中p27随AICAR处理降低,p21、p53变化相似,均是先升高后降低。 5、AICAR处理使TE1与TE13细胞内AKT的Ser473与Thr308位点的磷酸化水平均有明显提高,但HEEpiC细胞中仅有Ser473磷酸化水平升高。FOXO3的Ser253位点的磷酸化水平变化也与AKT活性状态一致。 6、AICAR处理使三个细胞系中Rictor水平升高,但PTEN的表达水平仅在HEEpiC细胞中升高,在TE1与TE13中未见明显变化。 结论: 1、AICAR 处理导致了人食管上皮细胞 HEEpiC、人食管鳞癌细胞 TE1、TE13增殖抑制,同时导致TE1、TE13细胞出现S期停滞,而HEEpiC细胞未出现明显改变。 2、AICAR 处理导致食管癌细胞株TE1与TE13出现S期停滞,主要通过激活AMPK 通路,一方面抑制mTORC1而抑制细胞增殖;另一方面磷酸化激活FOXO3,上调Rictor基因的表达从而活化mTORC2,后者导致AKT Ser473磷酸化并激活,从而通过调节下游相关G1/S期转换相关调节蛋白使细胞进入S期。 3、AICAR处理导致人食管上皮细胞出现增殖抑制但未出现S期停滞,主要是由于上调了PTEN的表达水平,从而抑制了mTORC2引起的AKT Thr308位点磷酸化激活;而在食管鳞癌细胞TE1与TE13中PTEN蛋白未出现明显上调,因此未能影响AKT Thr308位点磷酸化激活。