1.生物样品中盐酸雷诺嗪分析方法的建立目的采用蛋白沉淀法处理血浆和组织样品,建立以劳拉西泮为内标的高效液相-二级质谱法(HPLC/MS/MS)检测盐酸雷诺嗪的体内分析方法。方法色谱分离条件为:色谱柱:Eclipse XDB-C8柱(5μm,4.6×150mm);流动相组成为乙睛-水-甲酸(70/30/0.1,v/v)(PH=4.5),流速为0.8 ml·min-1;二级质谱检测离子对为:盐酸雷诺嗪(m/z 428.4/279.3),内标(m/z32 1.3/303.3),柱温35℃。结果建立生物样品预处理方法和HPLC/MS/MS法测定生物样品中盐酸雷诺嗪的含量,生物样品预处理方法回收率较高,色谱分离选择性好。生物样品中的内源性杂质不干扰盐酸雷诺嗪的测定,日间和日内的变异系数小于15%。生物样品最低定量限为0.0156 mg·L-1,标准曲线的相关系数R>0.99,质控样本及冻融实验符合要求,样品处理简单、快速,仅需微量的样品,而且其方法的灵敏度、重现性和精密度均较好。结论本法的准确度、精密度、灵敏度、专属性和定量线性范围均达到体内药物分析的要求。该方法可用于盐酸雷诺嗪的临床前药代动力学和毒代动力学研究。2盐酸雷诺嗪单次给药药代动力学研究和毒代动力学研究2.1 Beagle犬单次给药盐酸雷诺嗪的药代动力学和毒代动力学特征目的阐明犬单次经口给药盐酸雷诺嗪的的药代动力学和毒代动力学特征。比较有效剂量和最大耐受剂量下犬单次给药,盐酸雷诺嗪于犬体内的差异。方法取24只成年、健康Beagle犬,随机分为四组,分别单次经口给予盐酸雷诺嗪12.5、25、50和120 mg·kg-1,于药前和药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0小时取血,用HPLC/MS/MS法测定血浆中的盐酸雷诺嗪浓度,根据所得的血浆药物-时间曲线,采用房室模型和非房室模型推算药代动力学参数。结果盐酸雷诺嗪12.5,25,50和120 mg·kg-1四个剂量组平均达峰时间分别为:1.4 1 7±0.3 7 6,0.7 08±0.246, 1.08 3±0.2 0 4,0.75±0.224小时;平均峰浓度分别为:1.71±0.402,4.241±1.082,9.251±3.692,28.45±12.28 mg·L-1:半衰期分别为:4.167±0.636,5.353±3.38,4.341±1.427,4.861±2.347小时;统计矩药时曲线下面积分别为:3.803±1.369,8.488±1.728,14.453±3.408,49.684±17.11 mg·h·L-1。结论各剂量组给药后,盐雷诺嗪吸收迅速,1小时左右达峰,体内消除半衰期为4～5小时,给药后24小时体内药物基本消除完全,个体差异较大。在12.5,25,50和120 mg·kg1剂量下,盐酸雷诺嗪在Beagle犬体内药时曲线下面积与给药剂量成正相关,相关系数为0.9847,盐酸雷诺嗪体内过程为线性。盐酸雷诺嗪经口给药起始有效曲线下面积为3.088±1.369 mg·h·L-1。2.2大鼠单次灌胃给药盐酸雷诺嗪药代动力学和毒代动力学特征:目的研究大鼠单次灌胃给予盐酸雷诺嗪的的药代动力学和毒代动力学特征。方法取Wistar大鼠182只,雌雄各半,按体重随机分为4组。分别灌胃给药25、50、100和200 mg·kg1盐酸雷诺嗪(以雷诺嗪计),给药容积(1ml/100g)。给药前,动物需禁食12小时,给药后继续禁食3小时。分别于给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0小时从静脉窦取血离心取血浆。用HPLC-MS/MS法测定血浆中的盐酸雷诺嗪浓度,根据所得的血浆药物-时间曲线,非房室模型推算药物动力学参数。结果灌胃给药,盐酸雷诺嗪大鼠体内的药代动力学过程存在性别差异。灌胃给予25、50、100、200mg·kg1盐酸雷诺嗪后,雄性大鼠半衰期分别为0.799、1.545、1.645、2.737小时,达峰时间分别为1、0.25、0.5小时,峰浓度分别为:0.8558、1.94、5.556、7.906 mg·L-1,曲线下面积分别为1.618、2.875、13.877、33.64 mg.h·L-1。雌性大鼠半衰期分别为2.3 5 6、3.1 5、3.8 1、4.9 5 1小时;达峰时间分别为0.5、0.5、0.75、6小时;峰浓度分别为:3.427、558、21.78、32.566 mg·L-1;曲线下面积分别为13.899、31.829、113.826、201.185 mg·h·L-1。结论药物吸收快,一般0.25～1小时达峰,动物个体差异较大。盐酸雷诺嗪大鼠药代动力学过程存在性别差异,在雌性大鼠体内暴露量大,药时曲线下面积为雄性的5.98～11.07倍:在雌性大鼠体内的消除慢,消除半衰期为雄性大鼠的2～3倍。雌雄大鼠各剂量组的药时曲线下面积与给药剂量正相关,相关系数分别为0.9903和0.98,提示盐酸雷诺嗪大鼠体内药代动力学过程为线性。2.3盐酸雷诺嗪大鼠组织分布特征目的评价盐酸雷诺嗪在大鼠体内的组织分布特点,提示药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官,帮助确定毒性靶器官和解释毒理学结果。方法Wistar大鼠灌胃给药盐酸雷诺嗪200 mg·kg-1后,于药后0.25、0.5、1、3、6、12、24小时静脉窦取血后处死,立即取血液及各脏器组织,用滤纸吸干浮血,称重后均浆。用HPLC/MS/MS法测定各组织药物浓度。结果大鼠灌胃0.25小时,盐酸雷诺嗪在大鼠的12个受检器官内均有不同程度的分布。雄性大鼠:给药0.5小时,组织内药物浓度降序依次为:胃、肝、肾、肺、心脏、脾脏、骨骼肌、小肠、睾丸、脂肪、脑、肾上腺; 1小时后依次为:胃、小肠、肾、肝、脾、肺、心脏、骨骼肌、肾上腺、睾丸、脑、脂肪;以后除肾脏外,各器官药物浓度逐渐降低。6小时后依次为:肾、心脏、胃、肝、肺、脾、小肠、肾上腺、脂肪、骨骼肌、睾丸、脑。雌性大鼠:给药0.5小时,组织内药物浓度降序依次为:胃、肝、肾、小肠、心脏、脾、肺、骨骼肌、卵巢、肾上腺、脂肪、脑;1小时后依次为:胃、肾脏、小肠、脾、肝、心脏、卵巢、肾上腺、肺、骨骼肌、脂肪、脑;以后除肾脏、肺部(3小时达峰)外,各器官药物浓度逐渐降低。6小时后依次为:肾、肝、小肠、脾、肺、肾上腺、胃、心脏、脂肪、脑、骨骼肌、卵巢。结论盐酸雷诺嗪吸收较快,能迅速分布到以胃、小肠、肝、肾为主的12个待检组织内,大多于0.5～1小时达峰。与大鼠单次给药毒代动力学研究结果一致。盐酸雷诺嗪大鼠体内组织分布存在性别差异,药后各时间点雌性大鼠各组织器官的浓度普遍高于雄性大鼠,且消除慢,以肝脏、肺脏、脾脏和肾上腺尤其显著。药物在药效学靶器官心脏和毒性靶器官肾上腺未见蓄积。三盐酸雷诺嗪犬重复给药毒代动力学研究目的检测盐酸雷诺嗪重复给药于犬体内的暴露和蓄积情况。结合毒性研究结果确定药物无毒反应剂量和毒性反应剂量,全面认识药物毒性作用过程和毒性机制方法Beagle犬经口给予盐酸雷诺嗪20、40、80 mg·kg-1,每周给药6天,每天给药一次,连续给药周期为13周。按长期毒性实验研究方法评价药物毒性,并于给药后的第1和91天取血,取血点为药后的0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0小时。给药后恢复期第7、14和21天于上午8点取血。HPLC/MS/MS法检测Beagle犬体内盐酸雷诺嗪血药浓度,绘制血药浓度-时间曲线,采用房室模型和非房室模型推算药物动力学参数。结果盐酸雷诺嗪20 mg·kg-1·d-1给药后动物无明显症状,与对照组(Veh)组比较无异常。40 mg·kg-1·d-1给药可致动物体重增长减缓,其增长幅度明显低于Veh组,个别动物肾上腺空泡变性,其它未见明显异常。80 mg·kg-1·d-1给药犬普遍出现自主活动降低等多种毒性反应,长期给药可造成犬肾上腺空泡变性。第一天给药后,20,40和80 mg、kg-1三个剂量组的平均达峰时间分别为0.958±0.102,1.333±0.258,1.083±0.204小时,平均达峰浓度分别为1.997±0.249,3.49±0.401,16.105±1.74 mg·L-1,统计矩药时曲线下面积分别为:3.428±0.733,9.481±1.339,33.944±5.4 mg·h·L-1。在第91天给药后,三个剂量组的平均达峰时间分别为0.958±0.102,0.958±0.102,0.958±0.102小时,平均达峰浓度分别为2.27±0.209,4.973±0.491,22.46±4.972 mg·L-1,统计矩药时曲线下面积分别为:3.909±0.824,11.06±0.676,50.611±12.658 mg·h·L-1。恢复期第7天犬体内药物浓度已低于最低定量限。结论盐酸雷诺嗪在长期毒性条件下,各剂量组药物吸收快,达峰浓度较高,停药后消除快,动物个体差异较大。盐酸雷诺嗪在Beagle犬体内呈线性动力学过程,给药剂量与药时曲线下面积呈正相关,给药后第1天和91天的相关系数为0.9791和0.964。以毒性剂量40、80 mg·kg-1剂量重复给药三个月,末次给药后峰浓度和药时曲线下面积较首次给药有所增加,80 mg·kg-1剂量组尤其明显,但无统计学意义,提示毒性剂量下长期经口给药盐酸雷诺嗪,药物于犬体内暴露有蓄积倾向。