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目的:以端粒保护蛋白POT1作为诱饵蛋白,大规模发掘它的相互作用蛋白,试图构建以POT1为中心的蛋白质相互作用网络,为肝脏蛋白质相互作用网络的构建进行初步的基础性研究和原始数据积累。
方法:采用酵母双杂交技术,以POT1为一级诱饵筛选相互作用蛋白,以筛选到的猎物蛋白作为二级诱饵蛋白再次进行相互作用蛋白的筛选,再以二级诱饵筛选到的部分具有重要功能的猎物蛋白为三级诱饵蛋白,集中采用高通量酵母双杂交方法大规模筛选成人肝cDNA文库,得到更多相互作用蛋白。采用生物信息学分析方法对所获得数据进行系统的分析,用Osprey软件将结果视化,绘制相互作用关系网络图。
结果:在整个筛选过程中成功构建了多个诱饵蛋白的酵母表达载体进行级联筛选,其中一级诱饵POT1筛选到 5 个新的相互作用蛋白 HSCK2B,LAMC3,SERTAD1,MVP,GEF,以它们为二级诱饵进一步筛选到 TGM2,JAB1,HIVEP1,AGPAT2,CKAP4,HRSP12,CDC5L,RPS6,ATF4,NF-κB1,SHANK3,MCPH1,NR4A1,GSDML20,最后以这20个蛋白为诱饵,利用高通量酵母双杂交系统对成人肝cDNA文库的筛选,共获得236个相互作用蛋白,经过回转验证和生物信息学分析,最终得到107对高可信度的相互作用,基中102对为新发现的相互作用,这些相互作用构成了一个错综复杂的蛋白质相互作用网络。
结论:筛选得到的236对相互作用,其中107对为高可信度相互作用,他们构成了一个关系复杂的蛋白相互作用网络。新发现的这些相互作用对有助于研究单个蛋白的功能和转运机制,并为已知蛋白新功能的认识提供重要的功能线索,该网络为POTl的功能研究提供了新的启示和研究切入点,也为总课题肝脏蛋白质相互作用网络的构建积累了原始数据。