研究背景岭南地区气候炎热、雨水充沛,拥有独特的“湿热”环境。该地常年高温,雨热同季酿成岭南人的阳热体质,加之久居潮湿之地,嗜好生冷油腻,形成湿热为标的体质。而正是岭南地区这种温暖潮湿的气候、人口稠密,交通发达的环境,成为了病毒复制及流行的温床,加之岭南人湿热体质,也为病毒性疾病提供了易感条件。因此,岭南地区已成为传染疾病发生和流行的重要危险地带,许多传播病原如流感病毒、冠状病毒和轮状病毒等都在这里大量存在或最早发现,如2003年爆发的SARS首发病例就在中国南方。小鼠肝炎病毒属于冠状病毒的一种,其主要导致冠状病毒性肝炎,由于其不易感染人,如今已被用作研究人类冠状病毒良好的替代品,所以在岭南地区研究冠状病毒引起的湿热证意义重大。目前在市面上西医抗病毒感染的主要有疫苗和抗病毒制剂,但疫苗的制作存在滞后性,面对病毒的变异显得防不胜防；抗病毒的制剂也只有在早期才能达到预期效果,而中药在治疗此类疾病有独特优势。藏茵陈是藏药中最具特色的治疗肝胆系统疾病的良药,具有清热、解毒、清肝利胆功效,已被用于各种肝脏疾病的治疗,逐步受到相关专家和学者的重视。因此,探讨藏茵陈抗冠状病毒引起的湿热证作用相关机制,具有其独特意义,为该药治疗此类疾病打下理论基础。目的建立符合临床症状的冠状病毒性肝炎湿热证模型,评价造模因素对模型的作用地位,探讨模型的相关致病机制,并给予藏茵陈解毒汤进行治疗,观察药物对模型的作用,反证上述机理,为冠状病毒性感染湿热证提供新的致病机制基础理论和新的治疗药物参考。方法实验分为两个部分。第一部分：MHV-A59病毒性肝炎湿热证模型的建立。将12只SPF级BALB/c小鼠随机分为正常组和模型组,每组6只。由造模之日起,常温饲养9d,其中对照组用普通饲料喂养,模型组用高脂饲料(由80%普通饲料+8%蜂蜜+12%猪油配制,由广东省医学实验动物中心制备)喂养,两组均给予50g/d,自由饮水。至第10d时模型组用注射器腹腔注射MHV-A59病毒0.5m1,病毒稀释液浓度为10-5.5,对照组则腹腔注射等量的生理盐水,分别于病毒感染后第1d、3d和5d放入气候模拟舱(温度32±0.5℃,相对湿度60±5%)暴露3h,其余时间放置常温环境和肥甘饲料喂养,正常组于常温和普通饲料饲养。造模全程为15d。自造模1d、9d和14d的9：30AM在自然环境下(温度25℃,相对湿度60%)用数字肛温计和数字天平测量两组小鼠肛温和体重；于造模后眼球采血并离心得血清,解剖小鼠后将肝脏用4%多聚甲醛液固定。用磷酸甘油氧化法测定两组小鼠血清血脂四项,用ELISA法测定血清TNF-α含量,用HE染色法观察小鼠肝脏病理切片变化,用RT-PCR法检测小鼠肝脏MHV-A59病毒,比较两组小鼠肛温体重、血脂、TNF-α含量、肝脏病理变化及病毒感染确定。第二部分：藏茵陈及其复方对MHV-A59病毒性肝炎湿热证的作用及相关机制探讨。将64只SPF级BALB/c小鼠随机分成正常组、单纯湿热组(简称：湿热组)、单纯病毒组(简称：病毒组)、模型组、阳性药物组(简称：阳性组)、蒿芩清胆汤组(简称：蒿芩组)、藏茵陈解毒汤组(简称：藏复组)和藏茵陈组(简称：藏单组)8个组,每组8只。造模方法同实验第一部分,四个药物组由病毒感染后2h内给药,中药2次/d,西药1次/d。造模结束后制备血清和肝匀浆,用赖氏法测定血清ALT、AST含量,用TBA法测定肝匀浆MDA含量和SOD活性,用HE染色法观察小鼠肝脏病理切片变化,用分光光度法测定肝匀浆caspase3的活性,用荧光定量PCR法测定肝组织MHV-A59病毒含量、FasmRNA和caspase3mRNA的表达,比较不同造模因素组的肝功两项变化、脂质过氧化水平变化和caspase3活性的差异；比较模型组和各药物组之间肝功、脂质过氧化、病毒含量、病理切片以及FasmRNA和caspase3mRNA表达的差异。结果第一部分：MHV-A59病毒性肝炎湿热证模型的建立。1.模型组小鼠一般状态观察与正常组小鼠相比,模型组小鼠活动减少,呼吸急促,扎堆蜷缩,四肢瘫痪成壁虎状,反应迟钝,精神状态差,进食、饮水量明显减少,体毛脱落蓬松,体重明显减轻,大便粘滞,量多。肉眼下肝脏体积缩小,表面粗糙,有弥漫性出血点,质地脆,边缘锐,呈暗紫色。2.小鼠肛温、体重变化(1)造模1d时,两组小鼠肛温分别为：(34.37±0.38)℃和(34.63±0.36)℃；9d时分别为(34.35±0.16)℃和(34.87±0.28)℃；14d时(34.30±0.44)℃和(34.30±0.44)℃。两组小鼠相比,肛温变化差异有统计学意义(根据球形检验结果W=0.616,P=0.113,不拒绝球形假设,故F=70.167,P=0.000)。(2)造模1d时,两组小鼠体重分别为：(9.17±0.44)g和(9.44±0.39)g；9d时分别为(15.83±0.57)g和(18.05±0.51)g；15d时(18.02±0.19)g和(16.21±0.30)g。模型组小鼠在喂养高脂饲料9d时体重增加显著,至14d时(病毒+高温后)模型组小鼠体重有所下降,两组小鼠相比,体重变化差异有显著统计学意义(根据球形检验结果W=0.906,P=0.641,不拒绝球形假设,故F=5.509,P=0.000)。3.小鼠血脂变化正常组与模型组的TG分别为：(1.84±0.56)mmol/l和(4.70±0.95)mmol/l,差异有显著统计学意义(t=6.436,P=0.000)；两组的CHOL分别为：(4.02±0.28)mmol/l和(5.33±1.01)mmol/l,差异有显著统计学意义(t=3.042,P=0.024)。4.小鼠肝脏病理切片变化与正常组相比,模型组小鼠肝病理切片中肝小叶界限不清,塌陷,中央静脉周围肝细胞索排列紊乱、肿大,呈气球样变,胞质疏松淡染,细胞核大小、形状不一,胞浆呈嗜酸性,未见纤维间隔形成。5.小鼠血清TNF-α变化正常组与模型组血清的TNF-α含量为(147.16±4.76)pg/ml和(188.1610.09)pg/ml,模型组明显比正常组升高,差异有显著统计学意义(t=-8.987,P=0.000)。第二部分：藏茵陈及其复方对MHV-A59病毒性肝炎湿热证作用及相关机制探讨。1.肝脏MHV-A59病毒含量的变化各组小鼠肝脏病毒含量的相对拷贝数分别为：病毒组(22.9±3.55)、模型组(25.43±5.56)、阳性组(21.26±6.21)、蒿芩组(20.75±5.37)、藏复组(18.16±4.96)和藏单组(20.1±5.66)。各种药物对模型小鼠MHV-A59病毒含量均有不同程度地降低,其中以藏茵陈解毒汤作用最明显,差异有统计学意义(P=0.017)。2.小鼠肝脏病理切片的变化不同造模因素对肝组织有不同程度的损害性改变,其中以模型组最严重。在各药物组小鼠肝脏病理切片中,以藏复组、藏单组和阳性组效果为佳,肝细胞仍有肿胀呈气球样变,但破坏减少,排列以中央静脉向索状回归,细胞核相对完整,胞浆嗜酸性物质减少,由此可见三组药物组中以藏复组效果最为明显。蒿芩组肝脏病理切片改变不明显。3.小鼠血清肝功两项的变化各造模因素组小鼠血清ALT、AST分别为：正常组(10.28±2.22)U/L和(29.97±8.49)U/L、湿热组(13.03±2.51)U/L和(34.8±7.03)U/L、病毒组(194.7±24.49)U/L和(163.16±18.77)U/L、模型组(227.35±10.22)U/L和(180.82±17.34)U/L。病毒组和模型组ALT、AST与正常组比较差异有显著统计学意义(P=.001,P=0.000；正常组与湿热组比较无统计学意义(P=0.794,0.607)；模型组比病毒组升高明显,但差异无统计学意义(P=0.372,0.067)。各药物组小鼠血清ALT、AST分别为：阳性组(169.20±20.30)U/L和(137.931±12.197)U/L、蒿芩组(202.43±9.86)U/L和(175.146±14.781)U/L、藏复组(182.73±18.11)U/L和(145.08±20.423)U/L、藏单组(178.97±16.45)U/L和(139.824±13.153)U/L。与模型组比较,各药物组在肝功两项上均有不同程度的降低。藏复组和藏单组均有显著统计学意义(P=0.040,0.001,P=0.016,0.000),但两者比较无统计学意义(P=0.1000,P=0.577)。蒿芩组与藏复组相比,ALT差值无显著差异(P=0.632),AST差异有显著性(P=0.003)。4.小鼠肝组织脂质过氧化的变化各组小鼠MDA、SOD分别为：正常组(7.18±1.48) nmol/mg和(129.26±7.21)U/mg、湿热组(10.48±1.41) nmol/mg和(122.85±7.91)U/mg、病毒组(24.05±4.48)nmol/mg和(99.22±2.88)U/mg、模型组(39.03±7.76) nmol/mg和(94.82±11.13)U/mg。病毒组和模型组MDA含量明显比正常组和湿热组高,与正常组比较差异有显著统计学意义(P=0.000),湿热组MDA含量比正常组稍高,差异有显著性(P=0.011)；病毒组和模型组SOD含量明显比正常组和湿热组低,与正常组比较差异有显著统计学意义(P=0.000),湿热组与正常组比较,SOD差异无统计学意义(P=0.880)。各药物组小鼠血清MDA、SOD分别为：阳性组(21.30±3.44)nmol/mg和(120.01±9.02)U/mg、蒿芩组(29.07±3.94) nmol/mg和(106.00±5.12)U/mg、藏复组(23.61±5.56) nmol/mg和(118.11±12.17)U/mg、藏单组(26.14±5.65)nmol/mg和(114.07±8.90)U/mg。在MDA含量上,藏复组和藏单组与模型组比较的差异有统计学意义(P=0.013,0.049),两组之间比较无统计学意义(P=1.000)；在SOD活性上,藏复组和藏单组与模型组差异比较均有统计学意义(P=0.031,0.045),两组之间比较无统计学意义(P=1.000)。藏复组与蒿芩组比较MDA、SOD差异均无显著性(P=0.537,0.377)。5.小鼠肝组织caspase3活性的变化各因素组小鼠caspase3活性相对吸光度分别为：正常组(0.148±0.028)、湿热组(0.215±0.037)、病毒组(0.293±0.033)和模型组(0.371±0.051)。与正常组相比,湿热组、病毒组和模型组caspase3活性相对吸光度值均有不同程度的升高,其中以模型组最高,病毒组次之。三组与正常组比较差异有统计学意义(P=0.011,0.000,0.000)。各药物组小鼠caspase3活性相对吸光度分别为：阳性组(0.261±0.051)、蒿芩组(0.304±0.067)、藏复组(0.239±0.035)、藏单组(0.202±0.029)。与模型组相比,以藏茵陈单药组降低最多,其次为藏复组,差异均有显著性(P=0.000)。藏复组与藏单组、蒿芩组相比无显著差异(P=0.145,0.370)。蒿芩组在三组中药组中降低最弱,与模型组之间差异有统计学意义(P=0.000)。6.小鼠肝组织Fas mRNA和caspase3 mRNA表达的变化各因素组小鼠肝组织FasmRNA和caspase3 mRNA的相对拷贝数分别为：正常组(1.105±0.166)和(0.317±0.046)、湿热组(1.657±0.069)和(0.547±0.043)、病毒组(1.548±0.050)和(0.615±0.027)、模型组(1.930±0.080)和(0.867±0.102)。两种基因表达在湿热组、病毒组和模型组均有不同程度的上调,与正常组比较差异有显著性(P=0.000)。各药物组小鼠肝组织FasmRNA和caspase3mRNA的相对拷贝数分别为：阳性组(1.620±0.061)和(0.622±0.11)、蒿芩组(1.602±0.044)和(0.583±0.05)、藏复组(1.478±0.05)和(0.435±0.084)、藏单组(1.673±0.047)和(0.518±0.103)。与正常组相比,模型组小鼠肝细胞膜上FasmRNA表达明显增高,差异有显著统计学意义(P=0.000)；各药物组与模型组相比,对其表达均有不同程度的下调,三者与模型组的差异有显著统计学意义(P=0.001,0.000,0.003),其中以藏茵陈解毒汤效果最明显。模型组小鼠肝细胞内caspase3 mRNA表达比正常组明显增高,差异有显著统计学意义(P=0.000)；各药物组与模型组相比,对其表达均有不同程度的下调,三者与模型组的差异有显著统计学意义(P=0.000),其中以藏茵陈解毒汤效果最显著。藏复组与蒿芩组相比,两基因表达差异均有显著性(P=0.024,0.002)；与藏单组相比,Fas表达差异有显著性(P=0.001)。结论1.以MHV-A59病毒为生物致病因子,结合肥甘饮食及湿热外环境的复合因素构建的动物模型,从发病条件、表现和体征等方面符合湿热证的症状,可作为一种新型的温病湿热证动物模型,亦是对病证结合动物模型的一种新的探讨。2.藏茵陈解毒汤能有效降低病毒的含量及增加肝细胞的修复,从而减少肝细胞破坏导致的ALT、AST大量释放,起到较好的护肝作用。3.藏茵陈解毒汤能够改善肝组织脂质过氧化水平,有效下调肝细胞Fas和caspae3 mRNA表达,说明由Fas介导的肝细胞凋亡通路可能为MHV-A59病毒性肝炎湿热证的致病机制之一。4.藏茵陈及其复方的作用效果总体上比蒿芩清胆汤作用强,符合中医辨证论治思想。5.藏茵陈解毒汤与藏茵陈单味药相比,复方作用更显著,从而反证了模型肝细胞凋亡通路致病机制的存在,为中药复方建立规范、科学的评价标准提供实验依据。