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妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病,是导致孕产妇和围生儿病率及死亡率增高的主要原因之一。它的发病原因和机理目前尚不清楚,近年来越来越多证据表明妊娠期高血压疾病与遗传学因素有着密切关系。研究表明内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-a)在妊娠期高血压疾病的发病机理中有重要的作用,是与妊娠期高血压疾病关系密切的蛋白和细胞因子,参与该病的发生发展。本研究利用分子生物学技术在基因型分布、mRNA水平、蛋白质水平探讨了eNOS基因、TNF-a基因与妊娠期高血压疾病易感性的关系。在本研究中,从遗传学因素与其它发病因素相结合的角度,探讨与免疫学病因相关的TNF-a基因、与血管内皮细胞损伤性病因相关的eNOS基因多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用,以单基因假设、多基因遗传学说来解释该疾病,从而为建立和完善妊娠期高血压疾病的遗传学病因学说奠定基础。此外通过对未孕或早孕妇女易感基因多态性位点的检测,结合临床表现,可用于高危妊娠期高血压患者的筛查,将可以有效的对该疾病进行早期诊断和治疗。
第一部分:eNOS基因多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中作用的研究
分题一:eNOS基因第7外显子894位点G→T、第4内含子VNTR基因多态性与妊娠期高血压疾病易感性关系的研究
目的:探讨内皮型一氧化氮合酶基因第7外显子894位点G→T、第4内含子27bp可变数目的短片段重复序列(VNTR)的多态性现象与妊娠期高血压疾病易感性的关系。
方法:应用聚合酶链反应(PCR),聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测妊娠期高血压疾病患者和健康孕妇的eNOS基因第4内含子、第7外显子894位点G→T多态性。
结果:1.eNOS基因第7外显子894位点突变形成的T等位基因频率在正常孕妇组为6.87%、妊娠期高血压疾病组为23.00%,突变型T/G+T/T频率在正常组和病例组分别为13.75%和36.00%,差异有统计学意义
。2.eNOS基因VNTR4a等位基因频率在正常孕妇组为7.50%明显低于病例组16.00%,4a/4b+4a/4a基因型频率在正常组和病例组分别为13.75%和28.00%,差异具有统计学意义。
结论:eNOS基因第7外显子894位点G→T多态性、eNOS基因第4内含子VNTR与妊娠期高血压疾病遗传易感性相关,eNOS894G→T、VNTR4a等位基因是妊娠期高血压疾病的危险因素。
分题二:eNOS第7外显子894位点G→T多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中作用的研究
目的:探讨eNOS基因第7外显子894位点G→T多态性现象在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用,分析eNOS基因第7外显子894位点G→T多态性对eNOSmRNA、蛋白质表达以及血浆中NO水平的影响,进一步探讨eNOS基因第7外显子894位点与妊娠期高血压疾病易感性的关系。
方法:应用PCR-PRLP技术检测患者和健康孕妇的eNOS基因第7外显子894位点多态性。对两组之间的基因型和等位基因频率分布进行比较。采用RT-PCR技术检测胎盘中eNOSmRNA含量、硝酸还原酶法检测孕妇血浆NO3-/NO2-浓度水平(反映NO的良好指标)、Westernblot方法以及免疫组织化学技术分别检测胎盘中eNOS蛋白的含量,比较它们在不同组间的差异
结果:1.eNOS基因第7外显子894位点突变形成T等位基因频率及T/G+T/T基因型频率在两组分布同分题一。病例组中突变型T/G+T/T组的eNOSmRNA水平与野生型G/G组相比,差异无统计学意义。2.患者中突变型T/G+/TT组血浆NO3-/NO2-浓度水平明显低于野生型G/G组。3.病例组胎盘eNOS基因蛋白表达低于正常组,患者中突变型T/G+T/T组表达水平低于野生型G/G组。
结论:eNOS基因第7外显子894位点G→T的突变并未引起eNOSmRNA转录减少,但影响了血浆中eNOS基因表达产物NO水平及胎盘中蛋白的表达,是引起妊娠期高血压疾病的可能机制。
分题三:eNOS第4内含子VNTR基因多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中作用的研究
目的:探讨eNOS基因第4内含子27bp可变数目的短片段重复序列(VNTR)的多态性现象在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用,分析eNOS基因第4内含子多态性对eNOSmRNA、蛋白质表达以及血浆中NO水平的影响,进一步探讨eNOS基因第7外显子894位点与妊娠期高血压疾病易感性的关系。
方法:应用PCR技术检测患者和健康孕妇的eNOS基因第4内含子VNTR。对两组之间的基因型和等位基因频率进行比较。采用RT-PCR技术检测胎盘中eNOSmRNA含量、硝酸还原酶法检测孕妇血浆NO3-/NO2-浓度水平(反映NO的良好指标)、Westernblot方法以及免疫组织化学技术分别检测胎盘中eNOS蛋白的含量,并比较它们在不同组之间的差异
结果:1.eNOS基因VNTR4a等位基因频率及4a/4b+4a/4a基因型频率在两组的分布同分题一。病例组eNOSmRNA的表达明显低于对照组,病例组中突变型4a/4b+4a/4a组eNOSmRNA水平明显低于野生型4b/4b组(62.79±0.95比76.81±1.41t=11.63,P=0.012),差异有统计学意义。
2.突变型4a/4b+4a/4a组患者血浆中NO3-/NO2-浓度明显低于野生型4b/4b组患者。
3.病例组中eNOS蛋白表达低于正常组,突变型4a/4b+4a/4a组患者eNOS蛋白表达水平低于野生型4b/4b组患者。
结论:eNOS基因第4内含子VNTR的突变引起eNOSmRNA转录减少,影响了血浆中eNOS基因表达产物NO水平影响,胎盘中eNOS蛋白表达降低,是引起妊娠期高血压疾病的可能机制。
第二部分:TNF-a基因多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中作用的研究
分题一:TNF-a基因启动子-308G→A、-850C→T多态性与妊娠期高血压疾病易感性关系的研究
目的:探讨TNF-a基因启动子-308G→A、-850C→T多态性在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用。
方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测患者和健康孕妇的TNF-a基因启动子-308G→A、-850C→T多态性。对两组之间的基因型频率和等位基因频率进行比较,并采用分层分析方法评价两个基因多态性联合发生作用的效果。
结果:1突变基因型TNF2/1频率在病例组明显升高(18.87%比8.33%,x2=5.068,P=0.024,OR=2.56,95%可信区间1.11-5.92,P<0.05)。携带突变TNF2等位基因的个体比非携带者发生妊娠期高血压疾病的危险性显著增加。2病例组突变基因型CT+TT频率在对照组明显升高,18.52%比7.55%,x2=5.66,P=0.017,OR=0.359,95%可信区间0.151-0.865,P<0.05,突变等位基因T的发生率在正常组为25.93%明显高于病例组4.25%,x2=10.29,P=0.001,OR=0.298,95%可信区间0.137-0.648。
3由这两个多态性位点组成的不同基因型中,病例组TNF2/1CC基因型频率明显高于对照组(P<0.05),而T~1/1TT基因型频率在对照组明显增高(P<0.05)。
结论:TNF-a基因启动子-308位点C→T多态性与妊娠期高血压疾病具有相关性,-308位点的突变可能是危险性因素,-850位点的突变可能是保护性因素。TNF2/1CC基因型可能是妊娠期高血压疾病的易感基因型。
分题二:TNF-a基因启动子-308、-850C→T多态性与胎盘TNF-amRNA表达关系的研究
目的:在妊娠期高血压病例组和正常对照组胎盘中研究TNF-a基因启动子-308、-850位点多态性与TNF-amRNA表达的关系,以进一步探讨TNF-a基因多态性与妊娠期高血压疾病易感性的关系。
方法:采用RT-PCR技术检测胎盘中TNF-a的mRNA的含量在正常组和病例组之间、病例组中两种基因型之间是否存在表达水平的差异,分析TNF-a启动子-308、-850位点多态性分布特征及其与TNF-amRNA表达的关系。
结果:1.TNF2等位基因及TNF2/1基因型频率在两组中的分布同分题一。正常组胎盘中未发现有TNF-amRNA的表达,病例组中突变型TNF2/1组的TNF-amRNA水平明显高于野生型TNF1/1组,差异有统计学意义。2.病例组中突变型CT+TT组TNF-amRNA水平低于野生型CC组,差异有统计学意义。
结论:TNF-a基因启动子-308G→A多态性与妊娠期高血压疾病发生相关,该位点的突变引起TNF-amRNA转录增加,是引起妊娠期高血压疾病的可能机制。而-850C→T多态性引起TNF-amRNA转录减少,从而发挥保护性作用,可能是妊娠期高血压疾病的抗性基因。