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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高、发展迅速、转移早、浸润性生长、预后不佳。目前其治疗手段主要以手术切除为主,但其恶性程度高且极易转移和复发,所以手术根治性切除治疗的疗效有限。肿瘤细胞粘附性的异常是肿瘤侵袭转移和复发的重要因素。对粘附分子的研究已经成为了解肝细胞癌侵袭与转移机制的可靠途径。钙粘连蛋白是一种Ca2+依赖的介导同源细胞与细胞间相互粘附的粘连糖蛋白家族。研究表明,钙粘连蛋白在细胞的伸展和移动,细胞的信号转导与活化,细胞的生长及分化,细胞粘附,细胞识别以及肿瘤转移等病理生理活动中起到重要的作用。因此钙粘连蛋白的表达异常就会导致细胞的粘附功能出现紊乱,从而发生细胞结构改变和功能异常。肝肠钙粘连蛋白(Live intestine cadherin, LI-cadherin)是近年来发现的一类新型的钙粘连蛋白。国内外已有研究表明,LI-cadherin在胃癌、直肠癌等多种上皮来源肿瘤组织及癌组织周围有表达,并发现LI-cadherin与肿瘤细胞的转移和侵袭性相关。但是LI-cadherin与肝细胞癌的关系研究较少。本实验通过研究LI-cadherin在肝细胞癌组织和患者外周血清中中的表达,并分析LI-cadherin对人肝细胞癌的作用,并在此基础上通过转染LI-cadherin-SiRNA至肝癌细胞Hep3B和建立裸鼠转移瘤模型,在体外和动物模型中观察LI-cadherin对肝癌细胞株Hep3B生长、粘附和迁移的生物学行为的影响。为了解LI-cadherin在肝细胞癌的侵袭转移的作用和肝细胞癌的治疗提供思路和理论依据。第一部分肝肠钙粘连蛋白在肝细胞癌中的表达及意义目的：观察LI-cadherin在肝细胞癌组织中的表达,分析LI-cadherin的表达与肝癌临床病理特征的关系并探讨其临床意义。方法：采用免疫组织化学法检测56例肝细胞癌标本,45癌旁组织,10例正常肝脏组织中LI-cadherin的表达情况,并分析LI-cadherin与肝细胞癌临床病理特征的相关性。结果：1、LI-cadherin在肝细胞癌组织和癌旁组织中有不同程度表达,肝细胞癌组织中阳性率64.3%(36/56),显著高于在癌旁组织中阳性率15.6%(7/45)(P<0.05),10例正常肝组织标本LI-cadherin均表达阴性。2、LI-cadherin阳性表达与患者的年龄、性别、乙肝表面抗原是否阳性、肿瘤的病理学分级和包膜是否完整无相关性(P>0.05)；但LI-cadherin阳性表达与术前甲胎蛋白水平呈正相关关系(P<0.05)；与肝细胞癌的直径、是否有门静脉癌栓、肿瘤是否多发呈负相关(P<0.05)。结论：LI-cadherin的表达可能与HCC的发生发展密切相关,LI-cadherin可能具有抑制肝细胞癌生长的作用,并可能与肝细胞癌的侵袭转移能力有关。第二部分肝细胞癌患者外周血清中肝肠钙粘连蛋白的检测及其意义目的：检测肝细胞癌患者外周血清中LI-cadherin的含量,分析LI-cadherin在诊断和筛查肝细胞癌的意义。方法：采用ELISA法检测30例肝细胞癌患者术前的空腹血清标本和20例乙肝肝硬化排除肝癌的住院患者,20例健康志愿者的血清中LI-cadherin的含量,并分析其与临床病理特征的关系,联合检测LI-cadherin和AFP对肝细胞癌诊断的作用。结果：1、肝细胞癌患者外周血清中LI-cadherin的含量(2.374±2.446)显著高于肝硬化患者(0.558±0.563)和健康志愿者(0.682±0.703)(P<0.05)；肝硬化患者和健康志愿者外周血清中LI-cadherin的含量无显著性差异(P>0.05)。2、肝细胞癌患者外周血清中LI-cadherin的浓度与患者的年龄、性别、甲胎球蛋白是否阳性、乙肝表面抗原、肝癌组织是否有包膜、是否形成癌栓、是否为多发的病理特征无相关性(P>0.05)。而是与肿瘤的直径和肿瘤分期有关(P<0.05)。3、以LI-cadherin 0.900ng/ml为诊断阈值时,对肝癌的诊断价值灵敏度为：80%,特异性为75%。4、本组实验中AFP和LI-cadherin两者联合检测阳性率为93.3%(28/30),高于AFP阳性率(73.3%,22/30)和LI-cadherin的阳性率为(83.3%,25/30),但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：检测肝细胞癌患者外周血清中的LI-cadherin对诊断肝细胞癌有一定的价值。联合检测LI-cadherin和AFP对提高肝细胞癌的诊断可能有所帮助。第三部分肝肠钙粘连蛋白siRNA对肝癌细胞株Hep3B生长、粘附和侵袭力的作用目的：研究LI-cadherin-SiRNA对肝癌细胞株Hep3B生长、粘附和迁移能力的作用。方法：将建立LI-cadherin-SiRNA转染的肝癌细胞Hep3B,并观察转染效率；利用RT-PCR和Western blot检测转染后肝癌细胞Hep3B中LI-cadherin表达的变化；MTT法检测LI-cadherin对肝癌细胞生长和粘附的作用,Boyden小室侵袋这验检测肝肠钙粘连货白对肝癌细胞迁移的作用。结果：1、转染Ll-cadherin后肝癌细胞Hep3B中可见清晰的绿色荧光,转染率为80%,符合实验要求。2、空白对照组和空质粒转染组的LI-cadherin的mRNA和蛋白表达率无明显差异(P>0.05),SiRNA转染组LI-cadherin的mRNA和蛋白的表达均低于空白对照组和空质粒转染组。3、SiRNA转染组在12h、24h与空白对照组和空质粒转染组比较无差异(P>0.05),在36h转染组生长高于空白对照组和空质粒转染组,但是在统计学上无显著性差异(P>0.05),48h和72h肝肠钙粘连蛋白SiRNA转染组细胞株生长明显高于空质粒转染组和空白对照组,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4、三组粘附的细胞OD值分别为：SiRNA转染组0.655±0.040；空质粒转染组0.795±0.050；空白对照组0.82±0.026, SiRNA转染组显著低于空质粒转染组和空白对照组(p<O.01),对照组和空白组的差异比较无统计学意义(P>0.05)。三组穿膜的细胞数分别为：SiRNA转染组87.83±8.59；空白对照组67.50±8.50；空质粒转染组68.33±7.50, SiRNA转染组显著高于空质粒转染组和空白对照组(p<0.01),空质粒转染组和空白对照组的差异比较无统计学意义。5、Boyden小室迁移实验显示三组穿膜的细胞数分别为：肝肠钙粘连蛋白SiRNA转染组87.83±8.59；空质粒转染组67.50±8.50；空白对照组68.33±7.50。SiRNA转染组的穿膜的细胞数显著低于空质粒转染组和空白对照组,且其差异具有统计学意义(p<0.01),空质粒转染组和空白对照组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。结论：成功建立了转染LI-cadherin-SiRNA的肝癌细胞株Hep3B; LI-cadherin-SiRNA可抑制肝癌细胞株Hep3B中LI-cadherin基因和蛋白的表达；LI-cadherin可抑制肝癌细胞株Hep3B的生长,增加肝癌细胞Hep3B的粘附力和抑制迁移的能力。第四部分肝肠钙粘连蛋白在转移裸鼠模型中对肝癌细胞侵袭力的作用目的：研究LI-cadherin在裸鼠转移瘤体内对肝癌细胞株Hep3B侵袭转移能力的作用。方法：将裸小鼠30只随机分：空白对照组、SiRNA转染组和空质粒转染组,用Western blot方法检测三组裸鼠体内肿瘤组织中肝肠钙粘连蛋白的表达,通过检测肺及肝脏转移瘤个数和转移率分析LI-cadherin与肝细胞癌侵袭转移的作用。结果：1、SiRNA转染组的LI-cadherin的表达低于空白对照组和空质粒转染组,而空白对照组和空质粒转染组两者无明显差别。2、脾脏接种后空白对照组肝脏转移率为60%、SiRNA转染组转移率为80%、空质粒转染组转移率为50%, SiRNA转染组转移率高于空白对照组和空质粒转染组,但三组之间的差异无统计学意义(P> 0.05)。SiRNA转染组转移瘤数量(26个)显著高于空自对照组(15个)和空质粒转染组(14个)(P<0.05),而空质粒转染组和空白对照组无显著性差异(p>0.05)。结论：成功建立了人肝癌细胞株Hep3B肝脏转移瘤模型；SiRNA转染组总成瘤个数显著高于其他两组,提示LI-cadherin可抑制肝细胞癌在裸鼠体内的侵袭转移能力。