论文部分内容阅读
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种世界性大流行的烈性传染病,口蹄疫的爆发和流行给发病国家带来巨大的经济损失和政治障碍。许多国家特别是发展中国家,控制口蹄疫的主要手段是疫苗免疫。当前国内外采用的FMD疫苗免疫抗体检测方法主要是病毒中和试验、液相阻断ELISA以及固相竞争ELISA。这些方法虽然具有特异、敏感等优势,但操作复杂、费时、费力,需特定的仪器设备和专业技术人员,且需要病毒的参与,存在病毒灭活不全和病毒逃逸等危险。因此,建立一种安全、简便、快速、高效、准确的方法评价动物免疫保护水平至关重要。本研究通过蛋白的表达、纯化和复性;多肽的合成和筛选,获得了能和O型FMDV抗体特异性结合VP1蛋白和3条多肽,将VP1蛋白和合成肽分别作为免疫原和反应原成功制备3株特异性单克隆抗体;将金标BSA结合肽作为诊断抗原,以单抗IgG和SPA分别作为质控线和检测线,成功研制了O型FMDV抗体快速检测免疫层析试纸条,不仅为基层养猪业提供一种快速、特异、敏感、简便的O型FMDV抗体检测手段,还为动物疫病抗体水平监测建立了一种新型实用的方法。1. O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到全长639bp的O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体pET-VP1。重组质粒pET-VP1转化大肠BL21(DE3)菌株后,以0.5mmol/L IPTG诱导菌液,SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量45KDa处有明显可见的条带,与预期大小相一致。超声波裂解诱导表达菌体,对表达蛋白进行可溶性分析,结果显示大部分表达蛋白主要以包涵体形式存在。超生裂解收集包涵体经镍柱纯化,于8mol/L尿素缓冲液变性和复性缓冲液复性后,Western-blot和间接ELISA试验结果证实,该表达蛋白能与O型FMDV血清特异性结合,具有很好的生物活性,为FMDV单克隆抗体的制备和快速检测方法的建立奠定基础。2.猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定了基础。3.抗O型FMDV中和性表位单克隆抗体的制备与鉴定用表达的VP1蛋白免疫Balb/C小鼠,BSA-Pep2做为包被抗原,应用细胞融合技术融合,筛选出2C-A9、3D-A11、5G-E11共3株敏感特异的杂交瘤细胞,其分泌的mAb经间接ELISA鉴定,细胞培养上清效价分别为1:2.56×10~2、1:6.4×10~2、1:3.2×10~2,腹水效价分别为1:1×10~5、1:1×10~6、1:1×10~4,提纯的IgG效价分别为:1:1.28×10~5、1:1.02×10~6、1:512×10~5。WestGold试验结果表明,该单抗可以与VP1蛋白和合成肽特异性结合,与BSA和无关肽无非特异型反应。间接ELISA证实与原核表达的CSFV-E0蛋白和PRRSV-M蛋白无交叉反应性。液相阻断ELISA和双抗体夹心ELISA试验结果证明,该单抗可以特异性结合O型FMD病毒。该单抗的成功制备,为FMDV抗体快速诊断试纸条的制备奠定了基础。4.猪O型FMDV抗体检测免疫金标试纸的研制及性能测定依据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,以胶体金标记合成肽偶联BSA载体蛋白(BSA-Pep2)作为抗原,1.0mg/ml的SPA和0.54mg/ml的FMDV中和表位单抗分别作检测线和质控线,成功研制出检测O型FMDV抗体的快速检测免疫层析试纸条。敏感性试验证明,试纸条对O型FMDV多肽疫苗免疫后第8d的猪血清的敏感性可达到1﹕12800。特异性实验证实,该试纸条与CSF、SVD、PRRS、PR以及PPI阳性血清无交叉反应性;与A型、Asia1型FMDV阳性血清无交叉反应性,可以用作O型FMDV抗体的定型鉴定。免疫试验和田间应用试验结果证实,该试纸条可以用以评价O型FMDV疫苗免疫猪抗体产生情况,并与UBI ELISA试剂盒检测结果一致。