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天然免疫系统又称固有免疫系统,作为抵抗病原微生物的第一道防线对保护宿主免受侵染发挥着重要的作用,也逐渐成为免疫学研究的重点和热点。目前,一系列的模式识别受体已经被发现,并对其识别分子机制进行了研究。RIG-I样解旋酶受体是一类位于胞内的抗病毒模式识别受体,通过RIG-I信号通路传递信号最终引起抗病毒免疫反应。目前大部分研究集中在免疫应答模式,以及基因和信号通路的研究,而对于免疫调控机制的研究还不够系统和完善。近年来发现microRNA(miRNA)具有重要的调控功能,参与生命体多种活动的调节,如生物体生长发育,细胞繁殖,细胞凋亡及免疫活动等。因此在本文中我们通过构建small RNA文库,分析miRNA通过调控RIG-I信号通路来参与抗病毒免疫调节,并进一步分析了miR-145通过靶向MDA5来进行抗病毒免疫的调节,得到的主要研究结论如下:1.通过Illumina高通量测序平台对来自对照组(control group,CG)与感染组(infected group,IG)的样本进行测序获得两个small RNA转录组文库。经过筛选12,052,153和11,150,433条clean reads从对照组和感染组获得。通过blast将获得的clean reads与miRBase数据库进行比对,从对照组和感染组数据库分别鉴定出219和217种已知miRNA用于后续分析。对基因组序列上未被注释的sRNAs进行二级结构预测分别在两个数据库鉴定出75和69种novel miRNA。2.比较两个数据库中共有miRNA的表达量变化情况,发现poly(I:C)刺激后14个已知miRNA和8个novel miRNA表达量发生了显著变化。其中已知的表达显著差异的miRNA中有9个显著上升,5个miRNA表达量是显著下降的。在8个表达量显著变化的novel miRNA中,有2个表达量显著上升,而其他6个表达量显著下降。为验证数据库表达量分析的可信性,我们随机挑选了四个表达量显著差异的miRNA:miR-132,miR-155,miR-181,miR-190进行实时荧光定量PCR检测表达量变化,实验结果显示转录组表达量分析与实时荧光定量PCR结果一致,证明高通量测序数据是可信。3.研究表明miRNA通过调节靶基因的表达量来实现对各种生命活动的调节。本文中我们对表达量发生显著变化的miRNA进行靶基因预测,用来分析miRNA的免疫调控。其中来自RIG-I信号通路的基因:NLRX1,JNK,IRF3和CASP8等被识别为miRNA的靶基因,差异表达miRNA通过调控这些基因的表达来实现对RIG-I信号通路的调控。我们还通过分析miRNA与其对应靶基因的表达量了解miRNA对靶基因的负调控模式。这些研究为将来的鱼类miRNA免疫调控研究提供数据。4.RIG-I样解旋酶受体(RIG-I like receptors,RLRs)是一类胞内病毒识别模式受体。RLR家族包含三个基因:维甲酸诱导基因-I(retinoic acid induced gene I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)。其中RIG-I基因在很多鱼类物种中发生了丢失,LGP2由于缺少CARD结构域不能够激活下游因子引发抗病毒免疫反应。因此MDA5在鱼类病毒识别中具有非常重要的意义,了解MDA5的调控机制也非常重要。在本文中,生物信息学预测得出MDA5是miR-145的靶基因,进一步使用双荧光素酶报告基因系统进行了验证,并利用靶位点突变的方法确认了miR-145在MDA5上的靶识别位点。利用miR-145-5p模拟体和miR-145前体重组质粒(pre-miR-145)进行双荧光素酶报告基因实验,结果表明了MDA5为miR-145的靶基因,并且miRNA的敲降作用表现出浓度依赖和时间依赖的特性。本文还分析了poly(I:C)感染不同时间后miR-145-5p和MDA5在肝脏和肾脏中的表达量,表明miR-145-5p可能影响MDA5的转录水平进而调节信号通路。这些研究有助于我们了解miRNA在鱼类中的免疫调节作用,并为复杂的miRNA调节网络提供数据。