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背景和目的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL或Tc)在T细胞免疫应答中发挥着重要的作用,它通过识别靶细胞表面的MHC-肽复合物而对靶细胞进行杀伤。检测和监测抗原特异性CTL,是了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一,也是评价特异性免疫疗法的基础。抗原特异性CTL的体外检测方法有多种,但MHC-肽四聚体技术是目前唯一能够直接对其定量检测的方法。然而,MHC-肽四聚体构建过程复杂,价格昂贵,这在一定程度上限制其大规模应用,这就要求我们一方面要构建针对不同抗原表位的MHC-肽四聚体,另一方面也要求我们开展MHC-肽四聚体技术改造研究,简化MHC-肽四聚体制备过程,提高其实用性和可操作性,开发具有自主知识产权的产品,以适合和满足我国医学飞速发展的需要。另外,慢性HBV感染是一个全球性的重大健康问题。HBV有多种抗原成分,而每种抗原成分包含有多个抗原表位,构建HBV不同抗原表位的MHC-肽四聚体很有必要。本文首先使用MHC-肽四聚体构建的基本方法构建HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,一方面可以为检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL打下基础,另一方面摸索和掌握MHC-肽四聚体构建技术,可以为构建其它抗原表位的MHC-肽四聚体或为建立抗原特异性CTL检测的技术平台打下基础;其次将SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,以期为MHC-肽四聚体技术改造提供新思路。试验方法(1)HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体的构建分别将重组A2-BSP和β2m的载体用化学法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,对转化菌落进行培养和用IPTG诱导,表达出包涵体蛋白;提取两种包涵体蛋白,经SDS-PAGE电泳分析表明两个蛋白均被表达,大小分别为33KD和12KD;将两种包涵体蛋白和HBcAg107-115抗原肽共同稀释复性,以组装成MHC-肽复合物单体;用超滤器浓缩复性产物;用凝胶过滤层析技术纯化MHC-肽复合物单体,经SDS-PAGE电泳分析表明获得了目的蛋白;MHC-肽复合物单体在BirA酶的作用下生物素化;用超滤管离心去除生物素化产物中游离的生物素;用直接ELISA法定性鉴定生物素化产物;用BCA法测定生物素化蛋白浓度,并将生物素化蛋白和PE标记的链亲和素以4:1的量混合作用,从而得到MHC-肽四聚体。(2)HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体活性的检测取免疫的转基因鼠两只,其中一只为对照;取出脾脏,分离出脾脏细胞并调节浓度;先后用制备的MHC-肽四聚体、FICT标记的anti-CD8~+抗体和PE-Cy5标记的anti-CD3~+抗体对脾脏细胞染色,使用流式细胞术分析CD3~+、CD8~+和MHC-肽四聚体~+的细胞群频率。(3)SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体将BirA酶底物序列和PreScission蛋白酶切位点序列分别设计成引物,引物中引入BamHI和XhoI酶切位点,以pcDNA3.0-SCT为模板,通过重叠PCR技术,获得依次含PreScission蛋白酶切位点、SCT和BirA酶底物的基因序列;获得的基因序列用BamHI和XhoI酶后,与同样酶切过的载体pET32c(+)连接;连接产物用电转化法转化大肠杆菌JM109中;先进行抗性筛选,对获得的克隆再进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定,获得重组载体;用化学法将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中;对转化菌落进行培养和用IPTG诱导,分离菌体进行SDS-PAGE电泳分析,表明蛋白以包涵体存在,大小与预期一致;提取包涵体,进行稀释复性;用超滤器浓缩复性产物;复性产物换用PreScission蛋白酶缓冲液,加入PreScission蛋白酶以切除融合表达的标签;酶切产物经SDS-PAGE电泳分析表明大部分蛋白被切开;酶切产物先后经Ni离子亲和层析和GST亲和层析纯化,经SDS-PAGE电泳分析表明获得了纯的目的蛋白;对目的蛋白再进行和MHC-肽四聚体构建的基本方法一样的生物素化等过程,最后得到MHC-肽四聚体。(4)对比分析构建MHC-肽四聚体的两种方法,得出基于SCT构建MHC-肽四聚体的优越性。结果和结论(1)构建了有活性的HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,可以将其用于检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL。(2)构建了重组载体pSB1,为今后进一步研究SCT-BSP可溶性表达打下了基础。(3)将SCT-BSP构建成了MHC-肽四聚体,其方法相比构建MHC-肽四聚体的基本方法具有方便、快捷、节约成本和适合规模化生产等优势,为MHC-肽四聚体技术改造提供了新思路。