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研究目的
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是全球范围内流行的引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原体之一。RSV感染的主要组织病理学特征是小气道表皮的坏死、脱落,黏膜和黏膜下水肿、黏液分泌增加及气道阻塞[1]。囊性纤维化跨膜转运调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,CFTR)是分布于全身多个脏器分泌型上皮细胞顶膜的一种氯离子通道。在气道上皮,CFTR主要参与Cl—及HCO3—的分泌,调控气道表面液体层(Airway Surface Liquid,ASL)的渗透压、水合作用和pH值,使ASL维持在一个相对稳定的状态[2-4]。气道粘液高分泌是RSV感染后的重要特征之一,而CFTR通过对离子的转运参与调节气道粘液的分泌,因此我们猜测CFTR非常可能是RSV感染后引起呼吸道上皮分泌亢进的下游靶标。我们前期的研究工作也发现,RSV感染Calu-3细胞(人呼吸道黏膜下腺癌细胞)后,CFTR的基因和蛋白表达水平上调,蛋白功能活动增强。在动物模型上,我们发现RSV感染BALB/c小鼠第7天后,肺内CFTR的基因表达水平下调,而感染14天后,肺内CFTR基因表达水平上调。因此,本研究旨在进一步探索RSV感染小鼠后肺组织CFTR蛋白表达水平的变化,并初步探讨其分子机制。
研究方法
1.建立RSV感染小鼠模型。
10%水合氯醛或1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉BALB/c小鼠后,向感染组26只小鼠的鼻腔内左右交替滴入滴度为2.6×107PFU(plaque-formingunit,空斑形成单位)的RSVA2株的病毒液100μL。对照组26只小鼠以同样的方法给予等量的Hep-2细胞培养上清液。
2.通过RT-PCR验证感染模型是否成功建立。
在小鼠感染RSV后第4天、第7天及第14天,眼球取血后取40~50mg肺组织用于普通RT-PCR,检测RSV-G蛋白的核酸,验证小鼠是否成功被RSV感染。
3.使用蛋白免疫印迹法检测RSV感染小鼠不同时间段后,CFTR蛋白表达水平的变化。提取肺组织的总蛋白,应用蛋白免疫印迹法检测CFTR蛋白表达水平的变化,并用ImageJ软件对灰度值进行半定量分析。
研究结果
1.小鼠感染RSV后第4天及第7天均可在肺组织检测到RSV-G蛋白的核酸,而感染后第14天未检测到RSV-G蛋白的核酸。
2.(1)小鼠感染RSV后第4天肺组织CFTR蛋白表达水平与对照组之间无差异(P>0.05);
(2)感染后第7天肺组织CFTR蛋白表达水平出现下调(P<0.05);
(3)感染后第14天肺组织CFTR蛋白表达水平与对照组之间无差异(P>0.05)。
研究结论
RSV感染能影响CFTR蛋白的表达水平,且此作用呈现感染时间依赖性。
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是全球范围内流行的引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原体之一。RSV感染的主要组织病理学特征是小气道表皮的坏死、脱落,黏膜和黏膜下水肿、黏液分泌增加及气道阻塞[1]。囊性纤维化跨膜转运调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,CFTR)是分布于全身多个脏器分泌型上皮细胞顶膜的一种氯离子通道。在气道上皮,CFTR主要参与Cl—及HCO3—的分泌,调控气道表面液体层(Airway Surface Liquid,ASL)的渗透压、水合作用和pH值,使ASL维持在一个相对稳定的状态[2-4]。气道粘液高分泌是RSV感染后的重要特征之一,而CFTR通过对离子的转运参与调节气道粘液的分泌,因此我们猜测CFTR非常可能是RSV感染后引起呼吸道上皮分泌亢进的下游靶标。我们前期的研究工作也发现,RSV感染Calu-3细胞(人呼吸道黏膜下腺癌细胞)后,CFTR的基因和蛋白表达水平上调,蛋白功能活动增强。在动物模型上,我们发现RSV感染BALB/c小鼠第7天后,肺内CFTR的基因表达水平下调,而感染14天后,肺内CFTR基因表达水平上调。因此,本研究旨在进一步探索RSV感染小鼠后肺组织CFTR蛋白表达水平的变化,并初步探讨其分子机制。
研究方法
1.建立RSV感染小鼠模型。
10%水合氯醛或1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉BALB/c小鼠后,向感染组26只小鼠的鼻腔内左右交替滴入滴度为2.6×107PFU(plaque-formingunit,空斑形成单位)的RSVA2株的病毒液100μL。对照组26只小鼠以同样的方法给予等量的Hep-2细胞培养上清液。
2.通过RT-PCR验证感染模型是否成功建立。
在小鼠感染RSV后第4天、第7天及第14天,眼球取血后取40~50mg肺组织用于普通RT-PCR,检测RSV-G蛋白的核酸,验证小鼠是否成功被RSV感染。
3.使用蛋白免疫印迹法检测RSV感染小鼠不同时间段后,CFTR蛋白表达水平的变化。提取肺组织的总蛋白,应用蛋白免疫印迹法检测CFTR蛋白表达水平的变化,并用ImageJ软件对灰度值进行半定量分析。
研究结果
1.小鼠感染RSV后第4天及第7天均可在肺组织检测到RSV-G蛋白的核酸,而感染后第14天未检测到RSV-G蛋白的核酸。
2.(1)小鼠感染RSV后第4天肺组织CFTR蛋白表达水平与对照组之间无差异(P>0.05);
(2)感染后第7天肺组织CFTR蛋白表达水平出现下调(P<0.05);
(3)感染后第14天肺组织CFTR蛋白表达水平与对照组之间无差异(P>0.05)。
研究结论
RSV感染能影响CFTR蛋白的表达水平,且此作用呈现感染时间依赖性。