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背景及目的:脑血管疾病是常见病、多发病,病死率与致残率均高,幸存者中约3/4不同程度丧失劳动力,重度致残者占40%以上。脑梗塞(cerebral infaction,CI)是脑血管病中最常见者,约占75%。目前尽管对脑梗塞的治疗已取得了显著进展,但对于已发生坏死的脑组织,不能使梗塞区神经细胞再生,对于纠正脑梗塞后出现的神经功能障碍亦没有更好的对策。近年来,国内外进行的细胞移植实验,对中枢神经系统疾病具有潜在的治疗前景。研究发现,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)是中胚层来源的具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞,能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、成肌细胞和神经细胞等多种细胞成分。为进一步验证MSCs的这一潜能,本研究对大鼠MSCs进行体外分离、培养、扩增以获得大量MSCs,并将体外扩增后的细胞移植到脑梗塞大鼠体内,观察MSCs对脑缺血损伤的修复作用,探索一种治疗脑梗塞的新方法,并为干细胞治疗早日进入临床奠定基础。方法:采用密度梯度离心结合贴壁筛选的方法从6~8周龄Wistar大鼠骨髓中分离数量有限的MSCs,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,3~5d换液一次,直至融合时按1:3进行传代扩增。观察了培养的MSCs贴壁率、生长曲线和细胞周期、超微结构等生物学指标,并诱导其成骨、成脂分化。建立Wistar大鼠大脑中动脉阻塞(MCAo)模型,用线栓通过颈内动脉插入大脑中动脉起始端,2h后拔除线栓造成脑缺血-再灌注模型。将用DAPI荧光染料标记的MSCs通过立体定向移植到治疗组、假手术组大鼠壳核区,脑梗塞对照组移植不含细胞的培养液。观察移植入脑的MSCs在局部存活、迁移的情况;免疫组化染色了解MSCs的分化;电镜观察MSCs移植后脑梗塞区超微结构的改变;并通过MNSS量表、EEG、SEP等检测指标了解MSCs移植对脑梗塞的治疗效果。并且将用BrdU标记的MSCs经股静脉移植到大鼠体内,了解该途径移植是否可行。结果:①从大鼠骨髓中分离的单个核细胞具有自我更新能力和多向分化能力(能成骨、成脂分化),是我们所需要的骨髓间充质干细胞,能在体外环境下进行培养和大量扩增。②MSCs存活情况:移植入脑的MSCs在正常脑组织与梗塞区中能存活至少4W<WP=9>以上,但随着观察时间的延长,细胞数量逐渐减少,4W内组间无明显差异。③MSCs迁移情况:移植入脑的MSCs能向四周迁移,实验证明梗塞区微环境更有利于MSCs的迁移,移植后第3W在梗塞区的MSCs迁移范围明显大于正常的同部位脑区。④神经丝蛋白(Neurofilament , NF)免疫组化结果移植治疗组与脑梗塞对照组间无明显差异(P>0.05),两组的NF免疫组化光密度值(Optical density ,OD)和阳性细胞面积均明显低于假手术移植组(P<0.05)。而GFAP免疫组化结果,移植治疗组在移植后2W、4W均比另外两组明显增强(P<0.05)。⑤电镜观察的梗塞区超微结构显示,接受了MSCs移植的大鼠,梗塞区神经元胞浆中出现大量游离核糖体,可能与神经元的损伤修复有关。⑥MNSS量表、EEG、SEP检查结果,MCAo术后大鼠神经功能明显受损,接受MSCs移植后大鼠,各项检查指标于第2W开始恢复,与脑梗塞对照组相比有明显差异。⑦脑局部直接注射移植对脑组织的损伤不明显,假手术移植组,移植前后各项神经功能检查指标无明显改变。⑧经股静脉移植的MSCs,部分可到达脑梗塞局部。结论:1. 脑的MSCs能存活至少4W以上,并进行迁移。本实验发现,梗塞区比正常脑组织更利于植入的MSCs迁移。提示MSCs的迁移的原因可能与梗塞区微环境,包括炎症等缺血相关信号、各种细胞因子的生成等有关。2. 电镜观察的梗塞区超微结构变化可发现,行MSCs移植的大鼠,在梗塞区可见外形呈幼稚状态的细胞(考虑为植入的MSCs),细胞胞浆少,核致密,常染色质多,围绕在神经元周围,神经元中有较多的游离核糖体,脑梗塞区神经元的胞浆既有变性,又有丰富的游离核糖体,提示神经元处于修复状态。超微结构的变化提示部分移植入脑的MSCs与局部神经元发生整合,并对缺血损伤的脑组织具有一定的修复作用。3. 免疫组化结果提示移植入脑的MSCs成神经元分化不明显,但能间接证明MSCs在梗塞区被诱导分化为星形胶质细胞,并证明星形胶质细胞对缺血性脑损伤有明显的促进修复的作用。4. 与对照组相比,行MSCs移植治疗的大鼠,其MNSS量表测定的神经功能明显改善;SEP检查的P1-N1峰峰值、P1潜伏期、N1潜伏期明显好转;EEG结果慢波明显减少。以上结果均提示MSCs移植治疗脑梗塞大鼠有较好的疗效。5. 本实验采用了立体定向梗塞区直接注射移植和经股静脉注射移植2条途径移植MSCs,MSCs均能到达梗塞区。说明在脑梗塞条件下,MSCs能穿过血-脑屏障移行至脑损伤部位。其机制有待进一步研究。