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目的:1.利用Lewis lung cancer(LLC)肺癌转移模型研究吉非替尼联合四君子汤对荷瘤小鼠的疗效。2.探究吉非替尼联合四君子汤对肺癌转移前微环境的影响及其作用机制,以期为中西医联合治疗肺癌的临床用药对策提供科学依据。方法:首先将1×106个荧光素酶标记的LLC细胞接种于小鼠右后肢腋下,构建肺癌转移模型。然后将小鼠随机分为模型组,吉非替尼组,四君子汤组,吉非替尼联合四君子汤组。造模后次日灌胃给药。本文主要从两方面进行研究:1.吉非替尼联合四君子汤对荷瘤小鼠的疗效研究:观察实验期间小鼠日常活动状态和体重变化,评价吉非替尼联合四君子汤对荷瘤小鼠基本情况的影响;实验结束后,采用小动物成像技术检测肿瘤荧光发光强度,利用直尺测量肿瘤组织体积大小并称量肿瘤质量,评估吉非替尼联合四君子汤给药对荷瘤小鼠的抑瘤效果;称量心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等各脏器质量并计算各脏器质量指数,观察吉非替尼联合四君子汤给药对荷瘤小鼠各脏器的影响;分别采用TUNEL染色法和HE染色法考察吉非替尼联合四君子汤给药对荷瘤小鼠的肿瘤细胞的凋亡,肺部组织炎性浸润及肿瘤细胞转移的影响;借助Western Blot和免疫组化技术考察吉非替尼联合四君子汤给药对荷瘤小鼠肿瘤组织中EGFR/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平变化的影响。2.吉非替尼联合四君子汤对转移前微环境的影响:针对肿瘤免疫微环境的变化可能是四君子汤提高吉非替尼疗效的重要免疫学机制,根据文献报道采用LLC肺癌转移模型,选择14天这一时间点为转移前微环境,考察吉非替尼联合四君子汤对转移前微环境的影响。利用流式细胞技术检测荷瘤小鼠的外周血、脾、肺组织中免疫细胞的数量变化及免疫细胞表面相关受体的表达变化;借助Luminex细胞因子检测蛋白芯片检测小鼠肿瘤组织中肿瘤源性因子的表达水平,以期从免疫学角度考察吉非替尼联合四君子汤给药对荷瘤小鼠转移前微环境的影响,试图阐明四君子汤提高吉非替尼疗效的免疫学机制。结果:1.吉非替尼联合四君子汤对荷瘤小鼠的疗效研究:1)实验期间各组荷瘤小鼠日常活动状态和体重变化结果表明,随着肿瘤组织不断增大,模型组小鼠开始行动迟缓现象,精神状态不佳,吉非替尼与四君子汤组小鼠仍能维持日常饮水、进食活动;联合给药组,精神状态良好,活动较敏捷。各组小鼠体重均呈缓慢上升趋势,且各组之间无显著性差异。连续给药21天后,吉非替尼组、四君子汤组、吉非替尼联合四君子汤组的抑瘤率分别为45.7%、38.4%和84.8%,表明四君子汤可协同吉非替尼抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。与模型组比较,吉非替尼联合四君子汤组能显著提高脾脏脏器指数(P<0.05),对心脏、肝脏、肺脏和肾脏各脏器系数影响无显著性差异,表明吉非替尼联合四君子汤能增强小鼠免疫功能,且对其他脏器无明显毒副作用。给药45天后,模型组生存率为0%,吉非替尼组、四君子汤组、吉非替尼联合四君子汤组的生存率分别为40%、60%和60%,提示四君子汤可延长荷瘤小鼠的生存期。2)Tunel染色与HE染色结果显示,吉非替尼和四君子汤均可促进小鼠肿瘤组织细胞凋亡并抑制小鼠肿瘤细胞向肺部转移;与吉非替尼组或四君子汤组比较,吉非替尼联合四君子汤组具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),该结果提示四君子汤可协同促进小鼠肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞向肺部转移。3)Western Blot实验结果显示,与模型组比较,吉非替尼组和四君子汤组的p-EGFR、p-Akt、p-PI3K三种蛋白表达均呈现下调趋势;与吉非替尼组或四君子汤组比较,吉非替尼联合四君子汤组中三种蛋白均降低;而各组中Akt、PI3K两种蛋白表达未见明显变化,吉非替尼组和吉非替尼联合四君子汤组能够有效下调EGFR蛋白的表达,而四君子汤对EGFR蛋白表达量无明显影响。免疫组化实验结果显示,与模型组比较,吉非替尼组中的p-PI3K、p-AKT、EGFR、p-EGFR表达明显下调,四君子汤组中的p-PI3K、p-AKT、p-EGFR表达明显下调;与吉非替尼组或四君子汤组比较,吉非替尼联合四君子汤组中的p-PI3K、p-AKT、EGFR、p-EGFR表达显著下调。上述结果提示EGFR/PI3K/AKT通路可能在四君子汤提高吉非替尼疗效作用机制中发挥核心作用。2.吉非替尼联合四君子汤对转移前微环境的影响研究:1)流式细胞检测结果显示,在小鼠肺组织中,与模型组比较,吉非替尼组、四君子汤组和吉非替尼联合四君子汤组的中性粒细胞的百分比均呈显著性下降(P<0.05或P<0.01),但三组之间比较无显著性差异(P>0.05);在小鼠外周血和肺组织中,与模型组比较,四君子汤组与吉非替尼联合四君子汤组的中性粒细胞和单核细胞表面CXCR1、CCR2和c-Kit表达水平均呈下降趋势,但吉非替尼组单核细胞表面c-Kit表达水平呈显著性上升;在小鼠脾组织中,吉非替尼组CXCR1、CCR2和c-Kit表达水平均呈上升趋势,而四君子汤组和吉非替尼联合四君子汤组均呈下降趋势(P<0.05或P<0.01)。2)Luminex细胞因子检测蛋白芯片检测结果显示,在小鼠肿瘤组织中,与模型组比较,吉非替尼组的TNF-α表达水平显著性下降(P<0.05),IL-23、RANTES表达水平显著性升高(P<0.05),四君子汤组的GRO-α、IP-10表达水平显著性下降(P<0.05或P<0.01);吉非替尼联合四君子汤组的IL-12p70、IL-15表达水平显著性升高,IL-1α、IL-1β、IL-18、GRO-α表达水平显著性下降(P<0.05)。与吉非替尼组比较,吉非替尼联合四君子汤组的IL-1α、IL-6表达水平与四君子汤组的IL-6、IL-18表达水平均呈显著性下降(P<0.05)。上述结果表明,吉非替尼通过作用免疫细胞和细胞因子导致转移前微环境的炎性水平升高,而四君子汤通过改善转移前微环境的炎性水平,提高吉非替尼的疗效。结论:四君子汤可以通过改善转移前微环境的炎性水平提高吉非替尼的疗效。