第一部分:　　 前言：DICER属于RNaseⅢ(双链RNA特异性核酸内切酶)家族成员，由DICER基因编码。DICER蛋白是一种约210kD的多结构域蛋白质，包含四个ORF框架：DExH/DEAH解旋酶、PAZ、两个RNaseⅢ催化区、与双链RNA结合区DS-RBD。人类的DICER基因定位于14q32.2，在各种组织中广泛表达。DICER在RNAi过程中对于siRNA和miRNA的产生起着重要的作用。DICER能特异性地将长的双链RNA剪切为21～23nt5’磷酸化、3’端有2～3个核苷酸悬端的siRNA，以复合物的形式作用于微小RNA(microRNA，miRNA)和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的产生，后者特异性结合靶基因mRNA，引起转录水平、转录水平后水平或翻译水平的基因沉默，调控目的基因的表达。　　 RNA干扰(RNA Interference，RNAi)是双链RNA引起的同源mRNA特异性降解的现象。RNAi干扰现象广泛存在于生物界中。有多种酶和蛋白参与RNAi的过程。DICER蛋白能够促使miRNA和siRNA成熟，是RNAi机制和miRNA信号通路中的一种关键酶。目前，对DICER的认识主要局限于其对颈环或双链RNA的剪切功能。已有研究表明，DICER与动物生殖发育、肿瘤的发生发展密切相关。而与此相关的DICER凋控的分子机理尚不明确。因此，对DICER基因转录调控机制的研究具有重要的理论意义。　　 本研究利用生物信息学和分子生物学方法，探讨了转录因子NF-κB对DICER转录水平及其下游信号的调控作用，证明NF-κB/p65同源二聚体通过与DICER启动子的结合，在转录水平上调控DICER蛋白的表达，从而引起下游miRNA表达水平的改变。对于DICER条件敲除小鼠的进一步的研究表明，p65/DICER/miRNA信号通路是机体内存在的一种微调机制，对于维持机体内细胞因子的表达平衡起到重要的作用。这条信号通路对于生物体内由于LPS刺激所引起的TNF-α的产生起到重要的调控作用。　　 材料与方法　　 一、实验材料　　 1、人胚肾细胞系HEK293、人宫颈癌细胞系HeLa、小鼠巨噬细胞系Raw264.7　　 2、Real-time RT-PCR实验相关试剂　　 3、Western印迹杂交相关试剂　　 4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂　　 5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂　　 6、Elisa检测相关试剂　　 7、DICER转基因小鼠、Alb-Cre转基因小鼠　　 一、实验方法　　 1、应用软件分析DICER启动子结构，构建系列截短的DICER启动子萤光素酶报告基因载体，应用萤光素酶检测系统分析各段启动子的活性。　　 2、应用萤光素酶检测系统分析NF-κB激活剂和抑制剂刺激前后DICER启动子及其突变体的活性变化。　　 3、应用萤光素酶检测系统分析NF-κB p65及p50亚基对DICER启动了的活性影响。　　 4、EMSA方法体外鉴定DICER启动子区对NF-κB元件结合力的影响；ChIP实验进一步在体内条件下验证NF-κB特异性亚基与该位点的结合。　　 5、Real-time RT-PCR方法检测NF-κB p65及p50亚基对DICER mRNA表达水平的作用。　　 6、Western印迹杂交检测NF-κB p65及p50亚基对DICER蛋白表达水平的作用。　　 7、Real-time RT-PCR方法检测DICER下游microRNA表达水平的变化。　　 8、RT-PCR和ELISA检测p65/DICER信号通路对TNF-α表达水平的调控。　　 9、构建肝细胞DICER特异性敲除的小鼠。　　 10、构建急性肝损伤小鼠模型，Western印迹杂交检测DICER蛋白表达水平。　　 11、ELISA检测肝细胞特异性敲除DICER的小鼠中TNF-α表达水平的调控。　　 结果：　　 1、软件分析预测DICER启动子的位置及其中存在的潜在的转录因子结合位点；萤光素酶报告基因证实DICER的启动子区(-440～-195)以及NF-κB/p65亚基对DICER启动子活性的影响。　　 2、EMSA和ChIP实验分别在体外和体内条件下证明了DICER启动子区(-208～-199)为NF-κB/p65反应元件。　　 3、Real-time RT-PCR和Western印迹杂交证明NF-κB/p65及其激活剂LPS影响DICER mRNA和蛋白表达水平。　　 4、Real-time RT-PCR结果证明NF-κB/p65对DICER的转录调控，影响其下游miRNA的表达。　　 5、RT-PCR和ELISA结果证明p65/DICER信号通路调控TNF-α的表达水平。　　 6、肝细胞特异性敲除DICER的小鼠构建成功。　　 7、急性肝损伤小鼠模型构建成功，Western印迹杂交的结果证明DICER蛋白表达水平增高。　　 8、ELISA结果证明肝细胞特异性敲除DICER的小鼠中TNF-α表达水平远高于对照小鼠。　　 结论　　 1、DICER启动子区位于5’侧翼区(-440～-195)，-208～-199区为NF-κB/p65亚基的反应元件。　　 2、NF-κB/p65同源二聚体通过与DICER启动子结合，在转录水平上调控DICER蛋白的表达，从而引起下游miRNA表达水平的改变。　　 3、p65/DICER信号通路对于生物体内由于LPS刺激所引起的TNF-α的产生起到重要的调控作用。　　 第二部分：　　 前言：　　 卵巢癌在西方国家中是女性恶性肿瘤致死的主要原因。根据美国国家癌症中心2009年的统计数据，2009年美国国内新增21550例卵巢癌患者，有14600名患者死于卵巢癌。令人遗憾的是，卵巢癌在发病早期的放化疗治疗过程后，临床表现为容易复发，预后较差。因此，了解卵巢癌的发生发展机制可以为卵巢癌的治疗提供依据。　　 microRNA(miRNA)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约21～23nt，大多数的miRNA通过在翻译水平上介导其靶mRNA的降解或切割，对目的基因进行调控。成熟的miRNA通过与其目标mRNA分子的3’非翻译区(3’-untranslated region，3UTR)互补匹配使得靶基因mRNA的翻译受到抑制。最近的研究表明，miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化。此外，有研究表明，miRNA水平的下降和慢性淋巴细胞白血病的发生显著相关，提示miRNA和癌症之间可能有潜在的关联。而且，在临床标本的收集过程中，miRNA因为易于保持完整性，在对正常组织和癌症组织的判定上优于mRNA。　　 已有研究表明，在基因组的miRNA表达图谱中，miR-125b在人类的卵巢癌中出现异常表达。然而，miR-125b在卵巢癌发生发展过程中的分子机制尚不清楚。在本研究中，我们发现miR-125b的过表达可以抑制人类卵巢癌细胞系的增殖以及裸鼠体内卵巢癌细胞的生长。miR-125b促使卵巢癌细胞系细胞周期出现G2期阻滞。miR-125b在翻译水平上，抑制前癌基因BCL-3的表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖。我们的研究表明异常的miR-125b表达对人类卵巢癌的发生发展起到重要的作用。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、人卵巢癌细胞系SKOV3和ES2　　 2、临床卵巢癌患者及正常对照标本　　 3、Real-time RT-PCR实验相关试剂　　 4、基因克隆，点突变及萤光素酶报告基因检测相关试剂　　 5、细胞增殖实验相关试剂　　 6、细胞周期实验相关试剂　　 7、Western印迹杂交相关试剂　　 8、体外成瘤实验相关试剂，裸鼠　　 二、实验方法　　 1、Real-time RT-PCR方法检测临床标本中miR-125b的表达水平。　　 2、细胞生长曲线和克隆形成实验检测细胞增殖。　　 3、细胞周期分析miR-125b过表达的SKOV3稳定株细胞系。　　 4、应用萤光素酶检测系统分析BCL-3的3’-UTR是miR-125b的一个靶点。　　 5、Western印迹杂交检测miR-125b对内源BCL-3表达的影响。　　 6、体内成瘤实验检测miR-125b对体内卵巢癌发生发展的影响。　　 结果：　　 1、Real-time RT-PCR结果证明在39例卵巢癌临床标本(28例癌组织、11例正常组织)中，癌组织中的miR-125b的表达水平明显低于正常组织。　　 2、细胞生长曲线绘制和克隆形成结果证明，在miR-125b高表达的卵巢癌细胞中，细胞增殖和克隆的形成与对照组细胞相比明显降低；与之相反，在miR-125b低表达的卵巢癌细胞，细胞增殖与对照组细胞相比明显增加。　　 3、流式细胞分析和Western印迹杂交结果显示miR-125b过表达的SKOV3稳定株细胞系与对照组细胞相比，细胞周期出现G2期阻滞。　　 4、萤光素报告基因检测结果证明，BCL-33’-UTR是miR-125b的靶点。　　 5、Real-time RT-PCR和Western印迹杂交结果显示miR-125b是在翻译水平上抑制BCL-3的表达。　　 6、体内成瘤实验结果证明在体内环境下，高表达的miR-125b可以抑制卵巢癌细胞的发生发展，而低表达的miR-125b促进肿瘤的生成。　　 结论　　 1、miR-125b在人类卵巢癌中表达水平降低。　　 2、过表达的miR-125b会导致卵巢癌细胞出现细胞周期阻滞，降低细胞增殖和克隆形成能力以及在裸鼠体内的成瘤能力。　　 3、BCL-3是miR-125b在卵巢癌中的靶基因。　　 4、miR-125b在翻译水平上抑制前癌基因BCL-3的表达，进而抑制卵巢癌细胞的增殖。