研究背景和意义肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,仅次于膀胱癌和前列腺癌,占肾脏恶性肿瘤的80-90%。肾细胞癌起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,又称肾腺癌,简称肾癌,包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞亚型,RCC与肾小管上皮细胞病变相关。流行病学调查显示肾癌约占成人恶性肿瘤的2%-3%,,各国和各地区的发病率不同,发达国家发病率及死亡率高于发展中国家,我国各地区肾癌的发病率和死亡率差异也较大。RCC可发生于各个年龄段,高发年龄为50-70岁,男女之比值约为2：1。RCC的病理分类较多,共有10类,其中肾透明细胞癌(clear cell renal cancer, ccRCC)是最常见的。RCC的发病因素目前还不清楚,起病隐匿,早期缺乏特征性的症状体征,经典血尿、腰痛、腹部肿块“肾癌三联征”临床出现率不到15%。临床诊断缺乏可靠的实验室诊断指标,主要靠影像学检查,确诊需依靠病理学检查,RCC的早期诊断手段的缺乏使得早发现早治疗具有一定的困难。因RCC的多重耐药性和生物学特性,对放化疗及激素治疗均不敏感,手术治疗被认为是唯一可以治愈早期肾癌的方法,因此RCC的早期诊断仍是当前很多医学工作者研究的重点。目前一种新的利用高分辨率分析技术分析样品中系列小分子的代谢物图谱,进而筛选差异代谢产物作为标志代谢物的的方法引起了广泛的兴趣。代谢组学(metabolomics)是继基因组学,蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支。代谢组(metabonome)指一个细胞、组织或器官中所有代谢组分,尤指小分子物质,而代谢组学则是一门在新陈代谢的动态过程中,生物体(从细胞到整体生物)受刺激或紊乱前后(如将某个特定的基因变异或环境改变后)其代谢产物种类、数量及其变化规律,揭示机体生命活动代谢本质的科学。代谢组学研究的关键在于研究这些因内源性或外源性的刺激所引起的终端大量小分子代谢产物(主要是相对分子质量在1000以下的内源性小分子)的变化规律,进行快速、准确的分析鉴定,全面动态地揭示生理或病理状态下生物体对外界的应答反应变化过程,为了解RCC的发生机制提供一个新视角。联合细胞代谢组学和RCC患者体液代谢组学研究,能得到更多的疾病相关信息,有利于RCC的早期诊断。此外,本次研究的临床样本采用的是尿液样本,采集过程方便、无创无辐射,利于大规模的体检筛查。研究目的建立基于气相色谱质谱联用技术的肾癌细胞培养上清和RCC患者尿液的代谢组学研究方法,建立数据模型,筛选RCC特异性代谢标志物并加以验证,为临床RCC的早期诊断提供新的诊断标志分子。研究方法：1.细胞培养人肾透明细胞癌细胞786-0和HK-2细胞的培养按照常规的细胞培养方法,培养基质为含10%小牛血清的DMEM,置于37℃恒温、5%CO2的培养箱中培养,每24h用倒置显微镜观察细胞生长情况,每2-3天用胰酶消化、传代培养,取生长状态良好的细胞用于实验。2.制作细胞生长曲线细胞计数法测定786-0细胞及HK-2细胞的生长曲线按每孔0.5×104/mL细胞密度分别接种于24孔板中,培养条件如上。24h后计数,以后每隔24h计数一次,每次各取3孔细胞,分别计数,每孔重复三次,取其平均值。连续计数7d。根据细胞计数结果,以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标,以培养时间为横坐标绘制生长曲线。3.代谢组学样本采集、前处理及GC-MS检测体系的建立细胞水平的分析采用48h培养上清；临床样本收集27例RCC患者、26例泌尿系其它肿瘤及26例健康对照者的尿液标本。细胞上清采用含1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane,TMCS)的N-O-X2(三甲基硅基)三氟乙酰胺(trimethyl silane-N-O-double (three methyl silicon alkyl) fluoroacetamide,BSTFA)进行衍生化,尿液采用氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate, ECF)衍生化,然后进行GC-MS分析。该部分内容包括：(1)样本的前处理过程,含细胞培养上清及尿液的衍生化两种样本处理过程各相关影响因素的优化；(2)GC-MS分析条件的优化(电压、载气流速、是否分流及分流比、升温程序等)。4.数据分析,建立数据模型,筛选差异性代谢产物GC-MS分析之后产生海量的数据,为了充分获得GC-MS数据中的代谢物信息,对代谢组学中的数据分析主要采用化学计量学的方法,主要包括：(1)数据提取,利用XCMS等商业化的软件进行峰识别和数据转化；(2)进行背景扣除、滤噪、保留时间校正、谱峰匹配和归一化等数据前处理,以消除干扰因素的影响,增加数据的稳定性；(3)模式识别,利用SIMCA-P等类似的软件进行多变量分析,并通过总结、分类及判别分析建立相应的数学模型,如主成分分析(PCA)和最小乘法判别分析(PLS-DA),发现能有效表征RCC和对照组中细胞上清和尿液中主要差异性代谢物。5.谱库检索每个样品获得总离子流图后,利用仪器自带的NIST2011质谱数据库对全部代谢物进行鉴定,结合Scripps Center for Metabolomics (http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php)和HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/),鉴定内源性生物标志物,选择匹配度较高的内源性生物标志物作为鉴定结果。研究结果1.生长曲线表明,786-0细胞与HK-2细胞的生长速度相似,两种细胞都是从第2天开始进入对数期,在第4天进入平台期。细胞数目统计表明,在培养48h后,786-0细胞和HK-2细胞的细胞计数差异无统计学意义(p>0.05)。2.应用BSTFA和GC-MS分析786-0细胞与HK-2细胞的培养上清,建立其相应的仪器分析方法。应用自动峰识别程序和安捷伦7890A-5975C气相色谱质谱联用仪自带的NIST11.L进行谱库检索,实验共发现81个代谢物,其中匹配度高于80的代谢产物有48个,主要是氨基酸、糖类、有机小分子酸类以及胺类等。3.获得的数据首先用非监督的PCA进行比较,结果表明3个主成分的累积解释率R2Xcum=0.847, Score Plot得分图显示,786-0细胞和HK-2细胞在PC1的维和PC2维上有良好的分离趋势,表明肾小管的肿瘤细胞和良性细胞的代谢模式存在明显差异。4.运用有监督的PLS-DA的方法对786-0组及HK-2组的细胞培养上清数据进行建模,进一步验证分类结果的可靠性,该模型有较高的解释率及预测率(R2Xcum=0.809, R2Ycum=0.99, Q2Ycum=0.935)。 Score Plot得分图清晰显示,786-0细胞的样本点分散在左侧,而HK-2细胞分散在右侧,表明两种细胞的代谢模式存在差异,与PCA的结果相一致。5.通过寻找对区分786-0组及HK-2组代谢差异贡献较大的变量,本次实验共筛选出11种代谢产物,主要是氨基酸和糖等,它们分别是：丝氨酸、甘氨酸、N-乙酰-L-赖氨酸、苏氨酸、葡萄糖、2-丙烯酸、色氨酸、呋喃果糖、焦谷氨酸、L-岩藻糖和甘露醇,主要与氨基酸代谢和能量代谢有关。除甘露醇外,其它代谢物在786-0细胞上清中的水平均显著低于HK-2细胞(p<0.001)。6.应用ECF衍生化和GC-MS分析技术建立尿液分析方法,本次实验共发现119个代谢物,主要有氨基酸类、脂肪酸类、有机小分子酸类及胺类物质等。7.RCC组、TC组和HC组的PCA结果显示,主成分累计解释率为R2Xcum=0.846,Q2cum=0.575, Score Plot得分图显示各组分离趋势较好,但有离群点,需进一步分析。8.采用OPLS-DA的三组样本进行分析,并筛选差异变量。该模型有较高的解释率及预测率(R2Xcum=0.736,R2Ycum=0.974, Q2Ycum=0.897),但对区分病理类型效果不理想。本实验共筛选出14种代谢产物,分别是硬脂酸、苯丙氨酸、色氨酸、马尿酸、赖氨酸、吲哚乙酸、苯基丙二酸、丙二酸、戊酸、戊二酸、己二酸、6-甲氧基-硝基喹啉和氨基喹啉、喹啉。对筛选出物质进行t检验,结果显示,RCC组与健康对照组相比,其戊酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、吲哚乙酸、氨基喹啉及喹啉在尿液中的含量比正常人高(p<0.01),而戊酸、苯丙氨酸、6-甲氧基-硝基喹啉及色氨酸在尿液中含量则比泌尿系其它肿瘤的含量高(p<0.01)。结论1.基于三甲基硅烷化衍生的GC/MS分析适用于细胞培养上清的代谢组学研究,能准确区分肾癌细胞和良性细胞。2.基于ECF衍生的GC/MS分析适合于临床RCC患者的尿液代谢组学研究,能够准确区分健康对照组和肾癌患者的尿液。3.本研究筛选出的差异代谢产物有可能是表征肾细胞癌的潜在的生物标志物。