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目的:创伤弧菌溶血素A（Vibrio vulnificus hemolysin A,VvhA）是由结构基因VvhA编码的一种外分泌蛋白,具有溶血活性和细胞毒性。VvhA蛋白抗原性强,序列保守适合体外表达。此外,VvhA蛋白免疫小鼠能够产生中和毒素的VvhA抗体。因此,VvhA蛋白适合作为创伤弧菌候选疫苗。VvhA蛋白作为候选疫苗,其免疫保护效果尚需进一步验证,而免疫保护作用机制更需要深入探讨。本研究首先表达、纯化VvhA蛋白,制备VvhA蛋白疫苗,建立了VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。然后采用创伤弧菌毒力株感染小鼠模型,通过小鼠生存率、组织病理学、血清学和质谱成像检测,评价VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果。最后采用流式细胞术、免疫调控、转录组基因测序等技术方法,探讨VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护作用机制。本研究为创伤弧菌疫苗研究提供了实验依据,为寻求疫苗更强免疫保护效果提供新的实验方向。方法:1.采用IPTG诱导工程菌pET28a（+）-vvhA-Rosetta（DE3）表达重组蛋白VvhA。使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化蛋白。采用免疫印迹法对目的蛋白所携带的His标签进行鉴定;2.制备VvhA蛋白疫苗,建立VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。3.通过腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力菌株,采用血清学、病理学方法、质谱成像技术评价VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果;4.采用流式细胞术检测VvhA蛋白疫苗免疫小鼠的Th细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Th22）Tfh、GC B细胞的应答规律,初步探讨VvhA蛋白疫苗复杂的免疫保护作用机制;5.采用免疫阻断（小鼠腹腔注射IL-21中和抗体）和免疫增强（小鼠腹腔注射IL-21因子）两种手段调控IL-21水平,建立IL-21调控小鼠模型。小鼠腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力株。通过组织病理学检测,评价IL-21对VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果的影响;6.采用流式细胞术检测小鼠淋巴结Tfh/GC B细胞的应答变化。同时采用GCBI转录组基因测序检测IL-21调控基因的变化,探讨调控IL-21对VvhA蛋白疫苗免疫保护作用影响的免疫学机制。结果:1.IPTG诱导工程菌pET28a（+）-vvhA-Rosetta（DE3）表达大量的VvhA蛋白,然后经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后获得高纯度蛋白。利用紫外分光光度计检测OD260/280计算蛋白浓度为3mg/ml;制备了VvhA蛋白疫苗,建立了VvhA蛋白疫苗免疫的BALB/c小鼠模型。2.小鼠腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力株,72小时内,VvhA蛋白疫苗免疫小鼠存活率达到83.3%;对照组小鼠全部死亡。组织病理学检测结果显示,VvhA蛋白疫苗免疫小鼠肝脏和肺组织几乎没有损伤;对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞肿胀、坏死;肺组织出现肺间隔增宽,炎细胞浸润等病理改变。血清学检测结果（VvhA蛋白疫苗免疫组:ALT:40U/L,AST:139U/L;对照组:ALT:164U/L,AST:653U/L）与组织损伤结果一致;质谱成像结果显示,相对于VvhA蛋白疫苗免疫组小鼠,对照组小鼠肝脏组织中出现差异蛋白峰,且该蛋白在肝脏组织中的分布与H&E染色结果相对应。3.采用流式细胞术检测两组小鼠的脾脏和淋巴结Th/Tfh/GC B细胞应答变化,检测结果显示,相比对照组,VvhA蛋白免疫组小鼠Th1细胞、Tfh细胞和GC B细胞亚群应答明显增强。4.建立了IL-21调控小鼠模型。研究发现与IL-21因子阻断组（IL-21Ab组存活率为33.3%）相比,IL-21因子增强组能显著提高VvhA蛋白疫苗免疫小鼠的生存率,小鼠存活率达到100%。病理学检测结果表明,增强IL-21因子能显著降低创伤弧菌感染对小鼠脏器的损伤。5.采用流式细胞术检测IL-21调控小鼠淋巴结Tfh/GC B细胞的应答变化,检测结果显示,IL-21因子增强组的小鼠Tfh/GC B细胞应答显著增加。小鼠转录组基因测序结果显示,IL-21可诱导CXCR5等基因表达上调,而且这些表达上调的基因参与了趋化因子信号通路及细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路。结论:1.成功制备了VvhA蛋白疫苗并建立了VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。2.VvhA蛋白作为创伤弧菌候选疫苗具有很好的免疫保护效果。3.VvhA蛋白疫苗的免疫保护作用可能与Th1/Tfh/GC B细胞应答增强有关。增强IL-21因子后小鼠生存率提高,可能是通过上调CXCR5等基因,而这些表达上调的基因参与了趋化因子及细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路,从而增强VvhA蛋白疫苗的免疫保护效果。