家蚕不仅是一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目的模式昆虫,在科研和经济方面都具有重要的价值。激素在昆虫的生长发育过程中发挥着非常重要的作用,其中保幼激素（Juvenile hormone,JH）和蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）是最为重要的两大激素。家蚕（Bombyx mori）为鳞翅目模式昆虫,因此研究家蚕变态发育的机理有着重要的经济价值和理论意义。在家蚕血淋巴中存在一群高丰度蛋白,其分子量约为30 k Da而被命名为30K蛋白（30K protein,30KP）,其在血液中含量非常高,且具有结合糖与脂的能力,因此被认为是一种营养贮存蛋白,为家蚕的发育提供氨基酸和能量。除此之外,30KP基因的表达还具有四龄表达量低,五龄开始大量表达的时空特异性。这种时期表达特点刚好与家蚕保幼激素的滴度变化趋势相反。那么30KP基因的表达是否受保幼激素的调控?其受保幼激素调控的分子机制又是怎样的?本研究将围绕这些问题展开。本研究首先分析了30KP基因的时期表达模式,选取了五龄期高量表达的Bm LP1、Bm LP3与Bm LP4作为研究对象,分别从个体,离体培养的脂肪体以及细胞水平探究了保幼激素对30KP基因表达的抑制作用;其次,在细胞水平对其启动子活性分析,并通过对启动子序列的分析和转录因子预测,筛选出可能发挥抑制作用的转录因子:Homeodomain家族的Deformed（Dfd）及辅因子PBX;通过EMSA实验体外验证了Dfd和PBX与30KP基因启动子的结合;通过RNAi基因干涉及过表达的方法探究了Dfd和PBX对30KP基因表达的调控作用;通过GST-pull down和双分子荧光互补实验探究了这两个转录因子的互作。获得的主要研究结果如下:1.保幼激素对30KP基因表达的抑制作用我们选取了五龄期高量表达的Bm LP1、Bm LP3和Bm LP4三种30KP基因进行研究,首先利用q PCR方法对这三种30KP基因的时期表达模式进行了分析。结果表明在家蚕的脂肪体中,这三种30KP基因从四龄期到五龄第一天基本不表达,从五龄第三天开始表达。这一表达模式与保幼激素的时期滴度变化呈负相关的关系。用保幼激素类似物（JHA）处理家蚕五龄第三天幼虫,取处理后6h,12h,24h,48h的脂肪体,q PCR分析结果显示这三种30KP基因的转录均受到了抑制,而作为保幼激素下游响应因子的Bm Kr-h1则受保幼激素上调表达。用JHA处理家蚕离体培养的脂肪体10h后,q PCR结果显示这三种30KP基因的转录能被不同浓度的JHA所抑制。为了进一步分析保幼激素对30KP基因的转录调控机制,利用家蚕基因组数据库下载这三种30KP基因转录起始位点上游启动子区域,并分别将其克隆到p GL3-basic载体构成细胞转染载体,转染家蚕卵巢细胞Bm N,分析这三个启动子活性。双荧光素酶报告系统结果显示,Bm LP1启动子在Bm N细胞中没有活性,Bm LP3和Bm LP4启动子活性很高。在家蚕Bm N细胞中过表达保幼激素信号通路关键分子Kr-h1后,分析Bm LP3和Bm LP4启动子活性变化,结果显示Bm LP3和Bm LP4启动子活性均受Kr-h1所抑制。以上结果表明保幼激素可以抑制30KP基因的表达。2.调控30KP基因表达的转录因子的筛选已有研究发现Bm LP1启动上存在转录因子PBX的结合位点,且PBX可抑制Bm LP1启动子活性。我们对Bm LP3和Bm LP4启动子序列分析,发现Bm LP3和Bm LP4启动子上均存在PBX共有序列ANCAATCAW。查阅文献发现PBX是PBC家族蛋白,常作为Hox家族转录因子的辅因子发挥作用。通过转录因子预测网站（genomatix.de）分析发现,Bm LP1、Bm LP3和Bm LP4启动子上均存在许多Hox家族转录因子的潜在结合位点。PBX同源性比对分析表明,家蚕PBX与果蝇中的Exd同源性非常高,利用果蝇分子互作数据库（string-db.org）分析发现了可能与PBX存在相互作用的八种Hox家族转录因子。q PCR实验结果显示这些Hox转录因子与PBX的时期表达特征十分相似,即在四龄期及五龄初期表达量很高,而在五龄后期表达量很低,与30KP的表达模式刚好相反,暗示其可能协同抑制30KP基因的表达。为了进一步筛选与PBX协同发挥抑制作用的Hox家族转录因子,我们在Bm LP1、Bm LP4启动子上PBX结合位点附近预测到了Hox家族Dfd的结合位点,表明Dfd可能与PBX协同调控30KP基因的表达。3.Hox家族Dfd与辅因子PBX协同抑制30KP基因的表达为了验证Dfd与PBX是否参与30KP基因表达的调控,首先根据Bm LP3和Bm LP4启动子上预测的PBX结合的核心位点,选取该位点前后60bp区域合成探针。并构建FLAG标记的PBX过表达载体,转染家蚕Bm N细胞后提取细胞核蛋白进行EMSA试验,结果显示PBX也可以结合在Bm LP3和Bm LP4启动子上的预测位点。根据Bm LP1和Bm LP4启动子上预测的与Dfd结合的潜在位点,选取该位点前后60bp区域合成探针。构建MYC标记的Dfd过表达载体,转染家蚕Bm N细胞后提取细胞核蛋白进行EMSA试验,结果表明Dfd可以结合在Bm LP1和Bm LP4启动子上的Dfd潜在结合位点上,且该位点与PBX结合位点相邻。那么Dfd与PBX是否可以调控30KP基因的表达?在个体与细胞水平通过RNAi实验发现,当同时干涉Dfd与PBX后,三种30KP基因的转录水平均明显上调。相反,在细胞水平进行过表达实验发现,当同时过表达Dfd与PBX后,三种30KP基因的转录水平均被明显抑制。那么,Dfd与PBX之间是否存在相互作用呢。细胞亚定位分析结果显示Dfd与PBX都定位在细胞核,并且双分子荧光互补实验（Bi FC）结果表明Dfd与PBX在细胞核中存在直接相互作用,进一步的GST-pulldown实验也表明Dfd与PBX在体外存在相互作用。以上实验表明Hox家族转录因子Dfd通过与辅因子PBX结合来协同抑制30KP基因Bm LP1、Bm LP3和Bm LP4的表达。