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目的： 目前肝癌的发病率在全球高居第五位，是全球的高发性恶性肿瘤之一，在广西地区发病率高居全中国的榜首。现阶段的治疗手段多采用手术切除，放、化疗等常规传统手段为主。近年来，对于肿瘤治疗的新型理念的提出是基于肿瘤干细胞理论的提出并且广泛运用于体外多种实质细胞和动物的体内实验的展开。而且越来越多的证据指出肿瘤异质性的观点。说明肿瘤干细胞来源于肿瘤细胞内一群数量极少量生长极度旺盛，有着强大的自我更新、无限增殖化分化、潜能、高度致成瘤性的细胞。此类细胞在肿瘤的发生、发展过程以及肿瘤治疗后的复发、对放化疗的耐药等方面，都起到了极为重要的作用。而在肿瘤细胞中其他的多数细胞不具备无限增殖潜能，几乎遵循的是短暂的分化成熟以后，最终发展为死亡的过程。我们认为肝癌细胞中也存在着这样一组肝癌干细胞，我们的研究通过无血清悬浮成球培养出肝癌干细胞，初步探讨PI3K/AKT信号通路对肝癌细胞系MHCC-97H中CD90+干细胞比例及干细胞特性的影响。 方法： 1.采用完全培养基和无血清加入相关生长因子的培养基培养肝癌细胞系MHCC-97H，分别使其贴壁和悬浮成球，进行后续实验。 2.采用糖原染色的试剂检测球形细胞来源 3.采用细胞周期检测贴壁细胞和球形细胞这两种状态中细胞所处的周期分布 4.流式细胞术(flow cytometry)检测MHCC-97H细胞中贴壁细胞和悬浮成球细胞中流式抗体标记的CD90+细胞含量。 5.MTT检测PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理CD90+亚群和CD90-亚群后，两组细胞的增殖率。 6.LY294002处理MHCC-97H细胞系分选出的CD90+亚群后，用流式技术分析其CD90+干样细胞在加药前后含量的变化。 7.LY294002处理CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞后，其肝癌干细胞相关基因CD90，NANOG，SHP2的表达量的变化 8.Western blot检测其干细胞相关蛋白的表达。 9.平板克隆形成实验检测LY294002对MHCC-97H细胞中CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞克隆形成能力的影响。 10.比较不同浓度梯度的CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞在裸鼠皮下成瘤的能力，以及加入LY294002后成瘤能力的变化。 11.免疫组化：比较CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞在裸鼠皮下成瘤后，瘤体中所含的肝癌干细胞相关抗体的含量的多少;比较两个亚群细胞分别在使用PI3K/AKT通路抑制剂后，瘤体中所含肝癌干细胞相关抗体的含量的多少。 结果： 1.肝癌细胞系MHCC-97H细胞在完全培养基中贴壁培养约5天可以稳定传代;在无血清培养基悬浮成球培养约7-9天可以稳定传代。 2.糖原染色实验说明球形细胞是肝癌细胞来源的。 3.成球形的细胞的细胞周期处于相对静止状态，与干细胞的状态相似。 4.流式细胞仪检测肝癌干细胞标志物CD90在成球细胞中的表达量＞贴壁细胞中的表达量(P＜0.01)。 5.MTT检测CD90+亚群和CD90-亚群的细胞中，CD90+亚群细胞的增值率变化明显＞CD90-亚群细胞。 6.MHCC-97H细胞中存在CD90+肝癌干样细胞，经过LY294002处理后，CD90+亚群细胞在流式细胞仪检测下，肝癌干样细胞CD90+比例下降(P＜0.05)。 7.加入LY294002抑制剂后，肝癌干细胞相关基因CD90、NANOG、SHP2在CD90+亚群细胞中的qPCR的表达量比没有加入抑制剂的表达量明显下降(P＜0.05);而CD90-亚群细胞表达量变化不明显。 8.加入LY294002抑制剂后，Western blot的肝癌干细胞相关蛋白CD90、SHP2的表达量在CD90+亚群中下降明显(P＜0.05)。PI3K/AKT信号通路的下游特异性蛋白P-AKT的表达量下降(P＜0.05)。 9.LY294002可以显著降低CD90+亚群的克隆能力，对照组和处理组分别为(96.13±3.88)％和(60.82±7.03)％。对CD90-亚群的克隆能力影响不明显，对照组和处理组分别为(22.54±4.47)％和(19.62±3.21)％，P=0.41。 10.裸鼠皮下成瘤后，在相同的细胞数种植下，在CD90+亚群细胞成瘤明显比CD90-亚群细胞成瘤率大 11.LY294002能降低CD90+亚群细胞的成瘤能力，对CD90-亚群细胞影响不大。 12.CD90蛋白和SHP2蛋白在CD90+亚群细胞未加药时表达明显强于CD90+亚群细胞加抑制剂LY294002后的表达量;CD90-亚群细胞未加药的表达量与加药后变化不大。 结论： 无血清的特殊培养基能较好的富集肝癌干细胞，MHCC-97H细胞中的CD90+亚群细胞具有干细胞特性，MHCC-97H细胞中的CD90+亚群细胞的干性是PI3K/AKT信号通路依赖的。为进一步研究肝癌干细胞的特性及针对肿瘤干细胞的靶向治疗提供相关依据。