人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质,浓度可达42±3.5g/L。HSA提供80%的血浆胶体渗透压(colloid osmotic pressure, COP),其临床药效主要为血容量扩充、维持血浆胶体渗透压和血液稀释等。HSA临床适应症广泛,包括血容量不足、出血性休克、烧伤、白蛋白减少症、急性肝损伤、腹水、外科手术、急性呼吸窘迫综合征和血液透析等。近年来,由于血液来源短缺等原因致使HSA供应十分紧张,如何解决HSA的来源紧缺问题已成为目前HSA研究的热点。基于此,科研工作者主要围绕以下两个方面展开研究,寻找HSA的替代品,一是利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)对非人源白蛋白进行修饰以消除其免疫原性,但其安全性让人担忧；二是利用基因重组技术生产重组人血清白蛋白(recombinant HSA, rHSA)。目前,HSA已在细菌、真菌、植物及动物中成功表达,但由于HSAI临床应用剂量较大(每次可达5-10g)和rHSA产率较低等原因,实现高纯度、低成本的药物级rHSA的大规模生产是个极具挑战性的课题。此外,HSA的临床应用也存在一定局限性。如在烧伤、感染或失血等病理情况下,血管内皮细胞损伤,毛细血管通透性增加,血容量下降,及时有效地进行血容量扩充非常重要。然而毛细管渗透性增加可加速HSA的血管外渗,导致HSA血容量扩充作用维持时间较短,引起或加重组织水肿,不利于病情缓解。针对以上HSA来源短缺和血管保留率低等问题,本课题设想：采用PEG对HSA进行共价修饰,PEG分子具有巨大的水化体积,与HSA偶联后将赋予HSA较大的分子半径,从而减少血管渗漏,增加外源性输注的HSA的血管保留率使其充分发挥血容量扩充作用；同时PEG修饰能显著改善蛋白质药物的药代动力学性质,对HSA进行PEG修饰有望延长其生物半衰期,降低用药频率,在药物经济学方面也具有一定意义。本课题的主要研究内容及取得的成果有以下几个方面：1HSA的分离纯化及PEG定点和随机修饰产物的制备PEG修饰反应原料的纯度与修饰产物的均一性和反应产率密切相关,为了提高反应产率获得均一性良好的PEG修饰产物,本实验采用Sephacryl S-200凝胶柱层析和超滤法对血浆来源的HSA进行分离纯化。利用HSA分子上唯一的半胱氨酸残基,以相对分子质量(Mr)为20kDa的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)为修饰剂,对HSA进行Cys34定点修饰；利用N-末端氨基酸残基上的α-氨基和HSA主链上赖氨酸上的ε-氨基的pKa值不同,以单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)为修饰剂,对HSA进行N-末端定点修饰。采用单因素分析和正交试验优化反应条件,确定最佳反应条件。修饰产物经DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步分离纯化,获得Cys34定点修饰产物(PEG-cys34HSA)和N-末端定点修饰产物(N-terminal PEG-HSA)。同时采用氰尿酰氯活化的PEG对HSA进行随机修饰,制备Mr相当的随机修饰产物(random PEG-HSA),以作为体内外性质测定的对照品。结果显示,Sephacryl S-200凝胶柱层析和超滤法两步纯化可显著提高HSA纯度,HSA的纯度由纯化前的91%提高到99.8%。mPEG-MAL与HSA的最佳反应条件经单因素分析确定为：pH6.5、50mmol/L磷酸盐缓冲液(含10mmol/L EDTA); HSA浓度为5mg/mL; HSA:PEG摩尔比为1：2；37℃水浴摇床振摇20h,该最佳反应条下修饰产率达到50%以上。经SDS-PAGE检测粗略估计修饰产物的Mr约为90kDa,证实该修饰产物为单修饰产物。mPEG-ALD与HSA的最佳反应条件为：pH6.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液；HSA:PEG摩尔比为1：3；HSA浓度为5mg/mL;在反应结束前6h加还原剂NaCNBH3;4℃反应36h。按照以上优化的反应条件制备的HSA的N-末端定点修饰产物(N-terminal PEG-HSA)均一性好,SDS-PAGE检测单修饰率可达35%。PEG-cys34HSA和N-terminal PEG-HSA经DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步法纯化所得样品经SDS-PAGE检测纯度可达95%和91%。氰尿酰氯活化的PEG-6000与HSA的修饰产物分子量分布广泛,采用DEAE Cellulose柱层析和超滤法获得平均分子量约为90kDa左右的随机修饰产物,与定点修饰产物Mr相当,可作为体内外性质测定的对照品。2HSA及其PEG修饰产物的性质测定对HSA及其PEG修饰产物(PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA)的理化性质和修饰参数进行分析鉴定,主要包括修饰产物的二级结构、分子量、修饰位点和流体力学半径等。结果显示：利用圆二色谱法(CD)测定HSA及其PEG修饰产物的二级结构变化情况,修饰前后HSA的CD图谱峰形类似,几乎完全重合,这说明两者的二级结构几乎完全一致,提示PEG修饰并未影响HSA的二级结构；采用动态激光散射法(DLS)测得HSA、PEG-cys34HSA和N-terminal PEG-HSA的流体力学半径(Rh)分别为7.81、47.25和50.74nm, HSA经PEG修饰后,Rh增加为原来的6-6.5倍,HSA在水溶液中的流体力学半径显著提高；采用N-乙基马来酰亚胺(NEM)封闭法确定PEG-cys34HSA的修饰位点,SDS-PAGE证实NEM处理的HSA不能发生PEG化反应,以此证实修饰反应发生在唯一个游离半胱氨酸-34位半胱氨酸；采用高效凝胶渗透色谱-多角度激光散射联用法(GPC-MALS)测定N-terminal PEG-HSA的Mr为83.71kDa,确定该修饰产物为单修饰产物。3HSA及其PEG修饰产物的药物结合性质研究HSA是人血浆中含量最为丰富的一种载体蛋白,研究药物与HSA及其修饰产物的结合性质,对于了解药物在体内的转运、分布以及代谢过程具有重要意义。本实验采用表面等离子共振技术(SPR)研究了两种模型药物(华法林和萘普生)与HSA及其PEG修饰产物的相互作用。结果显示,SPR技术能够准确反映HSA及其PEG修饰物与药物的结合水平。采用解离平衡常数(KD)衡量配基(华法林和萘普生)与受体(HSA及其PEG修饰产物)的相互结合能力,硒值愈小结合能力愈大。华法林与HSA、 PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA相互作用的KD值分别为：12.9、24、14.2和67.6μmol/L,萘普生与HSA、PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA相互作用的KD值分别为24.6、36、27.7和44.7μmol/L。不同修饰位点对结合能力影响不尽相同,定点修饰对HSA与药物结合影响作用较小,与Cys34定点修饰相比,N-末端氨基定点修饰对HSA与药物的亲和力影响较小。而随机修饰由于其修饰位点较多且修饰位点不确定,能够明显降低HSA与药物的亲和力。4人血清白蛋白及其PEG修饰产物在小鼠体内的药代动力学和组织分布研究本实验采用1251放射标记法和三氯乙酸(TCA)沉淀法研究HSA及其PEG修饰产物在小鼠体内的血浆半衰期和组织分布等性质。结果显示,HSA及其PEG修饰产物在小鼠的体内过程符合二室模型,HSA、PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA(?)的消除半衰期(t1/2β)分别为9.51±2.22、21.91±2.00、22.50±1.70和22.93±1.51h,PEG修饰后t1/2柏延长为未修饰前的2.3-2.4倍左右。同时可以观察到,修饰产物的药时曲线下面积(AUC)和平均保留时间(MRT)都较未修饰前增大,血浆清除率(CL)也有所降低,以上结果均提示PEG修饰能够改善HSA在体循环的保留率。各修饰产物与HSA相比,各时间点的组织分布量相当,并未显示明显的组织分布特异性。5HSA及其PEG修饰产物在急性肺损伤模型中的毛细血管透过率和对脓毒症的药效学研究本实验采用内毒素脂多糖(LPS)吸入给药诱导小鼠急性肺损伤(ALI)模型,引起肺部毛细血管通透性增加,考察HSA及其PEG修饰产物在肺部毛细血管的渗出；利用LPS尾静脉注射诱导大鼠脓毒血症模型,以大鼠的红细胞压积(Hct)和平均动脉压(MAP)为考察指标,评价PEG-cys34HSA对大鼠脓毒血症的治疗作用。肺部毛细血管的透过率结果显示,三种修饰产物给药组的血管渗出量明显低于HSA,提示PEG修饰可有效减少HSA向肺实质的渗漏。HSA和定点修饰产物PEG-cys34HSA对脓毒血症的药效学研究结果显示,LPS给药后2h,各组的Hct均呈现上升趋势,MAP也呈现大幅度下降,降幅大于40mmHg,以上结果提示造模成功。HSA与PEG-cys34HSA给药后2h, HSA给药组的MAP由92±6mmHg上升为98±15mmHg,而PEG-cys34HSA给药组的MAP由92±12mmHg升至117±7mmHg,上升幅度明显高于HSA组(P<0.05)。同时,各组在给与液体输注后2h,Hct均有所降低,表现为血液稀释,血容量升高,其中PEG-cys34HSA血液稀释作用强于生理盐水组和HSA组(P<0.05),提示PEG-cys34HSA可更有效地扩充血.容量。本研究取得的主要成果和结论：1.采用mPEG-MAL和nPEG-ALD为修饰剂,与HSA反应能够获得均一的定点单修饰产物,修饰反应条件温和、操作简单、重复性好、单修饰率较高。采用DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步纯化可获得纯度较高的修饰产物。2.PEG修饰对HSA的二级结构影响较小,可显著增加修饰蛋白的水化半径。3.不同修饰位点对PEG修饰产物与小分子药物的结合能力影响不尽相同,定点修饰对HSA与药物结合影响作用较小,而随机修饰能够明显降低HSA与药物的亲和力。4.PEG修饰可延长HSA的消除半衰期,改善其血管保留时间,对HSA的组织分布影响不大。5.在LPS诱导的肺部毛细血管通透性增加的情况下,PEG修饰可减少HSA的血管透过率,因此有利于缓解水肿。在脓毒症模型的治疗中,PEG-cys34HSA能够更有效地回升血压和扩充血容量。