第一部分鱼藤酮立体定向注射制备帕金森病大鼠模型的实验研究目的一种好的帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）动物模型能够很大程度上促进其发病机制及治疗等相关研究进展。然而，目前还没有一种PD动物模型能够完全复制原发性PD的所有特征，包括多巴胺能神经元选择性变性、路易小体（Lewy body）形成等。本研究旨在探讨一种稳定、高效、耗费低、更能模拟人类帕金森病发病机制、病理、病理生理改变的动物模型制备。方法采用廉价且易获取的线粒体复合体I阻断剂鱼藤酮分别从颅内立体定向（ST）注射和背部皮下（SYS）注射制备帕金森病大鼠模型。ST注射是将鱼藤酮（3,6,12μg溶于1μl DMSO）定向注射至右侧中脑腹侧被盖区（VTA）以及黑质致密部（SNc）两点，SYS注射是将鱼藤酮（2mg/kg/day）溶于葵花油乳化液后背部皮下注射。通过行为学（ST大鼠注射APO诱导旋转行为）、组织染色（HE染色肝、肾、脾、胃、肺、心肌、骨骼肌等外周器官，TH、SNCA免疫组织化学检测多巴胺能神经元数量以及SNCA过表达情况）、HPLC（检测纹状体单胺类递质多巴胺以及5-羟色胺含量）、分光光度法（检测中脑GSH、SOD、MDA含量变化）以及透射电镜（多巴胺能神经元超微结构改变）鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型进行全面评价。结果行为学检测示大鼠症状呈慢性进行性发展，除出现APO诱导后的健侧旋转症状外，还有弓背、翘尾、少动、活动迟缓、静止性震颤、自我清洁能力下降等典型症状，尤其值得注意的是ST注射大鼠可以出现麻醉清醒后无需任何诱导的自发健侧旋转行为。纹状体和黑质区免疫组织化学染色显示多巴胺能神经元呈剂量依赖性减少，并伴SNCA表达增加。肝、肾、脾、胃、肺、心肌、骨骼肌HE染色可见鱼藤酮SYS注射后对外周器官有毒性作用，而ST模型中未观察到明显外周器官病理学改变。HPLC结果表明纹状体多巴胺含量明显减少，而5-HT含量无明显变化。氧化应激水平检测结果显示中脑GSH、SOD含量下降伴MDA含量增高。透射电镜结果表明鱼藤酮大鼠模型多巴胺能神经元中存在线粒体肿胀、线粒体嵴断裂、内质网扩张、核周间隙增大等超微结构改变。结论鱼藤酮ST和SYS注射均可制备帕金森病大鼠模型，然而，SYS注射大鼠外周器官可出现病变，肝肾最易受累，一定程度上限制了该模型的应用。不同于6-OHDA、MPTP，鱼藤酮ST注射制备的帕金森病大鼠模型不仅显示出静止性震颤、少动、活动迟缓等典型临床症状，而且多巴胺能神经元呈缓慢、进行性凋亡，更能模仿人类原发性帕金森病。并且，鱼藤酮对5-HT系统无明显影响，表明其对多巴胺能神经元损伤的特异性。另外，ST注射出模率高，动物死亡率低，并可通过麻醉清醒后自发旋转行为方便的对模型进行初步鉴定。因此，鱼藤酮立体定向注射模型是一种可靠的、更接近于原发性PD的动物模型。第二部分VEGF基因修饰脐带间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠模型的实验研究第一节脐带间充质干细胞的培养鉴定及腺病毒感染体外标记研究目的研究表明胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞等有移植治疗帕金森病的潜力，但受到来源、免疫排斥、伦理道德以及安全性等问题的约束。本研究旨在探寻一种易获取、来源广泛、不涉及社会伦理及法律方面争议、免疫源性弱的种子细胞，以移植治疗帕金森病等神经退行性疾病。方法经产妇同意后手术中采集脐带标本，置于含肝素（20-30u/ml）的PBS中带回，充分冲洗后分离血管组织，并将脐带剪成约1mm3的组织块，直接接种于含FBS（20％）和bFGF（10ng/ml）的DMEM/F12中培养，隔天换液。10天后弃除脐带组织块，以后每2-3天换液，待细胞长至80-90%融合后1:3-4传代。流式细胞术检测细胞表面标记CD10、CD13、CD14、CD33、CD34、CD49E、CD45和HLA-DR的表达情况，免疫细胞化学验证CD34、CD44和CD45的表达，透射电镜观察细胞超微结构。取P4代细胞进行成骨（地塞米松＋β-甘油磷酸钠＋维生素C）、成脂（地塞米松＋胰岛素）以及向神经系统细胞诱导分化（EGF+bFGF）以证明其多向分化潜能，并利用茜素红染色、油红O染色、以及Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色对诱导后细胞进行检测。使用携带血管内皮生长因子（VEGF）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组腺病毒载体以不同滴度感染脐带间充质干细胞（HUMSCs），于转染后48小时在荧光显微镜下观察，并采用流式细胞仪检测其感染效率，通过免疫细胞化学染色检测转染后细胞VEGF及EGFP表达情况，MTT法检测各组细胞活性以及Elisa法检测培养液中VEGF浓度。结果通过组织块培养法可以在短时间内获得大量纯化的HUMSCs，倒置显微镜下观察呈梭形或三角形，漩涡状生长，本实验室传至20代以后性状基本保持不变。流式细胞结果显示HUMSCs CD10（24.33%）、CD13（98.68%）和CD49E（99.17%）等表面抗原表达阳性，CD14、CD34、HLA-DR、CD45以及CD33表达阴性。免疫细胞化学再次证实CD33、CD45阴性表达，而CD44强阳性表达，表明该细胞非造血系统前体细胞或成纤维细胞。透射电镜观察HUMSCs胞体较小，核/浆比例大，染色质较疏松，核仁明显，表现为增值旺盛的早期细胞特点。成骨条件诱导HUMSCs三周后茜素红染色可观察到钙结节；成脂诱导后HUMSCs倒置显微镜下可观察到小脂滴，油红O染色阳性；神经细胞诱导后HUMSCs可检测到Nestin、NSE和GFAP的表达。腺病毒感染后的HUMSCs激光共聚焦显微镜下可观察到其胞浆中VEGF和EGFP共表达，腺病毒感染对HUMSCs无毒性作用，高感染滴度组（MOI=200，400）HUMSCs的增殖明显活跃，与未转染细胞相比，MTT吸光度值具有显著性差异，培养液中的VEGF浓度随感染滴度增大而增高。结论HUMSCs易于获取，增殖速度快，短时间内可以大量扩增，临床上干细胞治疗面临的来源困难、细胞数量少、免疫排斥、伦理道德等问题都迎刃而解。本研究优化HUMSCs培养方法，使用组织块培养法代替传统的酶消化法，减少操作步骤及科研消耗。HUMSC体外培养可以成功的诱导为骨、脂肪以及神经系统细胞。干细胞腺病毒感染基因修饰以及荧光标记操作简单，标记比率高，检测方便，值得推广。总之，HUMSC是一种理想的治疗帕金森病等神经退行性疾病的种子细胞。第二节VEGF修饰脐带间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠模型目的脐带间充质干细胞（HUMSCs）是一种易获取、来源广泛、不涉及社会伦理及法律方面争议、免疫源性弱的种子细胞，移植后可改善帕金森病动物模型临床症状。本课题组前期研究表明，人血管内皮生长因子165（VEGF）基因治疗（“in-vivo” gene therapy）可对多巴胺能神经元发挥保护作用。本研究旨在探讨VEGF修饰后HUMSCs （“ex-vivo” gene therapy）对帕金森病大鼠模型的治疗作用，并进一步观察移植后HUMSCs的成活、分化以及安全性。方法构建携带VEGF和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒表达载体（Ad-EGFP和Ad-VEGF-EGFP）感染第五代HUMSCs48小时。鱼藤酮立体定向注射制备的帕金森病大鼠模型随机分为三组：Saline组（纹状体内注射10μl生理盐水）, Ad-EGFP组（纹状体内注射10μl生理盐水，含1×106Ad-EGFP感染的HUMSCs），Ad-VEGF-EGFP组（纹状体内注射10μl生理盐水，含1×106Ad-VEGF-EGFP感染的HUMSCs）。分别从行为学、黑质区TH阳性神经元计数、纹状体TH免疫反应性评价HUMSCs对帕金森病大鼠模型的治疗作用，免疫荧光检测移植后HUMSCs向神经干细胞、神经元、胶质细胞以多巴胺能神经元分化情况，纹状体HE染色检测HUMSCs移植后的是否有肿瘤样结构形成，并采用Elisa法测定纹状体内VEGF蛋白表达量。结果腺病毒（Mol400pfu/cell）持续感染48小时后目的序列表达率可达91.9%±2.6%。MTT提示病毒感染对HUMSCs无毒性作用，高表达目的序列VEGF可促进HUMSCs存活及增殖。HUMSCs移植后可有效缓解阿朴吗啡诱导的旋转行为（移植后12周Ad-VEGF-EGFP组、Ad-EGFP组相对于Saline组分别下降了53.21%、72.44%，P<0.05），减少黑质区多巴胺能神经元（三组受损侧TH阳性细胞计数分别为对侧的26.87%、55.46%和89.51%，P<0.05）及其末梢变性（受损侧纹状体TH染色光密度值分别为对侧的6.97%、57.89%和87.61%，P<0.05），VEGF基因修饰可进一步加强这一治疗作用。VEGF基因修饰可以增加HUMSCs向Nestin（增加21.64%，P<0.05）、NSE（增加18.80%，P<0.05）、TH（增加30.27%，P<0.05）阳性细胞分化比率，减少其向GFAP（减少36.92%，P<0.05）阳性细胞分化。纹状体HE染色未发现任何肿瘤样结构。与对照组相比，Ad-EGFP组和Ad-VEGF-EGFP组动物纹状体VEGF蛋白表达量分别上调49.58%（P<0.05）和255.46%（P<0.05）。结论HUMSCs是一种理想的帕金森病治疗种子细胞，也是一种很好的基因治疗载体。VEGF基因修饰可以增强HUMSCs的治疗作用，VEGF基因修饰联合干细胞移植治疗是一种很有潜力的帕金森病保护治疗策略。第三部分脐带间充质干细胞移植后长期疗效及安全性的实验研究目的脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs）是一种理想的帕金森病治疗种子细胞，本课题组前期研究已初步探讨HUMSCs移植治疗后的疗效以及安全性。本研究旨在观察HUMSCs移植后的长期迁移、分化、疗效、致瘤性和致痫性。方法使用细胞膜红色荧光染料DiI（10μM）标记第五代HUMSCs，并将鱼藤酮立体定向注射后的帕金森病大鼠模型随机分为两组：Saline组（纹状体内注射10μl生理盐水）, HUMSC组（纹状体内注射10μl生理盐水，含1×106DiI标记的HUMSCs）。HUMSCs移植后12个月，分别从行为学、黑质区TH阳性神经元计数、纹状体TH免疫反应性评价HUMSCs对帕金森病大鼠模型的治疗作用；通过荧光显微镜观察全脑连续切片中DiI阳性细胞的分布分析HUMSCs的迁移；免疫荧光检测移植后HUMSCs向神经干细胞、神经元、胶质细胞以多巴胺能神经元分化情况；并通过肿瘤相关蛋白Bcl-2、P53、PCNA、β-catenin、C-myc和NF-κB免疫染色以及HE染色检测HUMSCs移植后潜在致瘤性；通过化学致痫剂戊四氮给药后CD50和CD97值检测HUMSCs移植后潜在致痫性。结果DiI标记HUMSCs成功率可高达99.8%±0.1%，移植后在活体内其荧光可保持12个月以上。全脑切片显示HUMSCs主要集中于损伤侧大脑半球，可由纹状体迁移至黑质。 HUMSCs移植治疗12个月后可有效缓解阿朴吗啡诱导的旋转行为（降至32.52%，P<0.05），减少黑质区多巴胺能神经元（减少48.40%，P<0.05）及其末梢变性（减少56.95%，P<0.05）。移植后HUMSCs可以分化为Nestin、NSE、GFAP、TH阳性细胞，并且，黑质区可检测到HUMSCs来源的TH阳性细胞。移植后的HUMSCs高表达Bcl-2（升至281%，P<0.05）和p53（升至200%，P<0.05），PCNA、β-catenin、C-myc和NF-κB表达在Saline组和HUMSC组之间无明显差异。HE染色未观察到任何肿瘤样结构。戊四氮给药后CD50和CD97值在Saline组和HUMSC组之间亦无明显差异。结论本研究结果表明，HUMSCs移植是一种长期有效且安全的帕金森病治疗策略。另外，如何有效调控HUMSCs定向分化为多巴胺能神经元，以及HUMSCs移植于灵长类后长期安全性还需进一步评估。