【摘 要】
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目的:选取皖南地区蝮蛇蛇毒冻干粉,从中分离得到抑瘤组分-Ⅰ（Agkistrodon Halys venom antitumor component-I,AHVAC-Ⅰ）,分离纯化人原代胃癌相关成纤维细胞（Gastric cancer associated fibroblasts,GCAFs）,探索AHVAC-Ⅰ通过作用人原代胃癌相关成纤维细胞进而抑制胃癌细胞的迁移能力及其分子机制。方法:收集胃癌组
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目的:选取皖南地区蝮蛇蛇毒冻干粉,从中分离得到抑瘤组分-Ⅰ（Agkistrodon Halys venom antitumor component-I,AHVAC-Ⅰ）,分离纯化人原代胃癌相关成纤维细胞（Gastric cancer associated fibroblasts,GCAFs）,探索AHVAC-Ⅰ通过作用人原代胃癌相关成纤维细胞进而抑制胃癌细胞的迁移能力及其分子机制。方法:收集胃癌组织,利用组织块培养法、差速贴壁法和胰酶消化法分离纯化GCAFs,通过细胞形态观察和免疫细胞化学方法对原代GCAFs进行鉴定。以GCAFs和胃癌细胞株MKN-28作为后续实验对象。采用细胞毒性实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验,通过计算AHVAC-I对GCAFs的半数抑制浓度(Half inhibitory Concentration,IC50)确定后续实验中AHVAC-I实验组的浓度（2、4、8μg/ml）。以AHVAC-Ⅰ处理GCAFs 72h后的培养上清培养胃癌细胞MKN-28,采用划痕实验和Transwell实验检测MKN-28的迁移能力,探讨AHVAC-I对GCAFs诱导胃癌细胞迁移的能力的影响。运用ELISA法检测AHVAC-I处理后的GCAFs分泌的CXCL12水平;Real-time PCR与Western blot检测AHVAC-Ⅰ作用后GCAFs CXCL12的表达水平,分析AHVAC-I对于GCAFs分泌CXCL12的影响,阐述AHVAC-I通过作用GCAFs抑制胃癌细胞迁移能力的机制。结果:1.成功分离培养出原代GCAFs。形态学观察发现分离得到的原代GCAFs呈纺锤形,形态体积大小不等,细胞排列紊乱,胞突较多,胞核可见切痕,核仁多见。免疫细胞化学鉴定结果表明:分离得到的GCAFs高表达间叶细胞标志物Vimentin;作为GCAFs的特征性标志物的α-SMA在分离纯化得到的GCAFs表面高表达,且表达水平明显高于Vimentin;上皮细胞标志物CK-18在分离得到的GCAFs表面不表达。2、以不同浓度AHVAC-Ⅰ（1.5、3、6、12、24、48μg/ml）处理GCAFs 72h,CCK-8的结果表明AHVAC-Ⅰ能够抑制GCAFs的增殖,并且呈浓度依赖效应,数据分析IC50值为8.133μg/ml,根据IC50结果将AHVAC-Ⅰ的实验浓度定为2、4、8μg/ml三个浓度组。3、AHVAC-I作用GCAFs 72h后,以培养上清培养胃癌细胞株MKN-28。24小时后,MKN-28细胞的迁移能力明显低于对照组,GCAFs对胃癌细胞的促转移作用受到显著抑制。ELISA结果表明AHVAC-Ⅰ作用后GCAFs分泌的参与调控胃癌细胞迁移的CXCL12水平显著下降;Real-time PCR及Western blot结果表明AHVAC-I可显著抑制GCAFs表达的CXCL12水平。结论:1、组织块消化法与胰酶消化共同作用,可成功分离出原代GCAFs。2、AHVAC-Ⅰ可通过作用胃癌肿瘤微环境中的GCAFs细胞抑制胃癌细胞的迁移。3、CXCL12可促进胃癌细胞的迁移,AHVAC-I可通过抑制GCAFs合成分泌CXCL12的能力,抑制GCAFs促进胃癌细胞迁移的能力。
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