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GAP-43是一种神经组织特异表达的小分子,它在神经发育和神经再生过程中表达,促进轴突生长和突触形成,因此人们普遍把它看作是促进神经生长的内在决定因子。最近,一些研究发现其还与神经发生过程密切相关。我们的前期研究发现,GAP-43可以延长细胞周期时间,特别是选择性延长G1期,而细胞周期(尤其是G1期)的延长则是决定细胞命运去向(增殖还是分化)的关键因素。因此,我们拟从钙调蛋白(Calmodulin,CaM)角度揭示GAP-43参与细胞周期调控的分子机制。为此,我们将GAP-43(野生型及2种突变型)转入NIH3T3细胞,通过构建的不同NIH3T3细胞模型,观察GAP-43是否在CaM参与下影响细胞周期的调控。研究的实验组由3T3-G(表达野生型GAP-43)、3T3-A(表达非磷酸化GAP-43)和3T3-D(表达假磷酸化GAP-43)组成;另设对照组(转染空载体NIH3T3细胞)。用免疫组化、Westernblot、MTT、累积BrdU标记和脉冲式BrdU标记(PLMlabelling)等方法,比较上述各组、特别是3T3-A和3T3D组细胞周期动力学;再用Westernblot方法测定结合了CaM的GAP-43是否影响了CDK2、CDK4的核转位。以此进一步创新对GAP-43参与细胞周期调控分子机制的认识。研究结果如下:
1.成功构建表达不同类型GAP-43的NIH3T3细胞模型,分别命名为3T3-A、3T3-D、3T3-G和3T3-P。
免疫组化和Westernblot都显示,三种不同NIH3T3细胞分别成功表达野生型GAP-43(3T3-G)、非磷酸化GAP-43(3T3-A)和假磷酸化GAP-43(3T3-D);对照组NIH3T3细胞也成功转染空载体。免疫共沉淀显示3T3-A细胞内GAP-43和CAM相互结合;3T3-G细胞中仅有一部分GAP-43与CAM结合;3T3-D和3T3-P细胞内没有GAP-43与CAM的结合。
2.证实3T3-A(表达有与Calmodulin结合的GAP-43)细胞生长减缓。
采用细胞计数法分别描绘3T3-A、3T3-D、3T3-G和3T3-P各组细胞的生长曲线,发现3T3-P细胞生长最快,3T3-D、3T3-G细胞增殖速率变缓、两组基本同步,3T3-A最缓慢。
3.证实3T3-A(表达有与Calmodulin结合的GAP-43)细胞生长减缓与细胞周期延长有关。
应用累积BrdU标记法测定细胞动力学显示,3T3-A和3T3-D组相比细胞周期延长,而增殖比例没有降低。表明与CaM结合的GAP-43可能通过延长细胞周期使细胞生长变慢。
4.间接证明3T3-A组细胞周期延长与细胞G1期延长相关。
通过脉冲式BrdU标记(PLMlabelling)法测定G2/M期,显示3T3-A3T3-D组细胞相比G2/M期没有差异,从而间接表明与CaM结合的GAP-43是通过延长G1期来延长细胞周期的。
5.证实3T3-A细胞中GAP-43结合Calmodulin后会减少CDK2、CDK4的核转位。
运用Westernblot,显示3T3-A和3T3-D相比其CDK2、CDK4的核转位明显减少,表明GAP-43与CaM结合后,会减少CaM对CDK2、CDK4的核转位作用。
通过上述结果可以表明,Calmodulin参与了GAP-43延长细胞周期、尤其是延长G1期的作用。因此本研究结论是:GAP-43通过结合Calmodulin,减少了CDK2和CDK4的核转位,延长了细胞周期、尤其是延长了G1期,抑制了细胞的生长速度。