研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性免疫炎症性疾病,高血脂、高血压、肥胖等传统的心血管疾病危险因素只能解释约40-50%的AS患者的患病的病理生理学机制,大约40%的没有传统的危险因素的AS患者则与慢性应激有关。虽然有越来越多的临床流行病学研究资料表明慢性温和应激(chronic mild stress, CMS)在AS性病变中有着重要作用,但对其在AS发生与发展中的作用机制至今尚未阐明。研究表明,CMS应激还能诱发机体的慢性免疫炎症应答,但对其导致慢性炎症发生的分子机制有待进一步的研究。鉴于通过人体研究资料来阐释CMS在AS性疾病发生与发展中的作用及其机制存在诸多的限制因素,因此,建立适当的CMS动脉粥样硬化动物模型来探讨其在AS中的作用机制显得尤为重要。由于apoE-/-小鼠对CMS应激敏感性好;能自发性地发生AS病变,且其好发AS病变的部位和性质与人类AS极其相似,因此本研究采用CMS apoE-/-小鼠模型来研究CMS在AS发生、发展中的作用及其免疫学机制。天然免疫在AS性疾病的发生与发展、在CMS诱导的应激反应中都有着重要作用。天然免疫通过识别被称为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的高度保守抗原域,是机体抵御微生物入侵的第一道屏障。Toll样(Toll-like receptor,TLR)识别种类繁多的PAMP,属于模式识别受体。目前人类TLR家族至少有10名成员已被发现。TLRs与配体结合后激活NF-κB等信号转导通路,诱导炎性细胞因子的转录(如TNF-α),进一步激活细胞的免疫功能。实验提示:TLR4是连接免疫、脂质代谢与AS的桥梁;在慢性应激所致的免疫应答中也可能有着重要作用。因此,本研究通过建立CMS apoE-/- AS小鼠模型来探讨CMS对AS的发生与发展的影响,及其TLR4途径在该模型小鼠AS发生、发展当中的作用和机制。目的1.慢性温和应激能否加速apoE-/-小鼠AS的发生与发展。2.慢性温和应激对apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号通路基因表达的影响。3.构建Ad-TLR4 siRNA干扰载体并转染apoE-/-小鼠,研究TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展的影响及其对主动脉TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达的影响。方法1.慢性温和应激apoE-/-AS小鼠模型的建立及其TLRs信号通路基因表达研究1.1实验动物应激方案4周龄apoE-/-小鼠120只平衡一周后随机分为2组:对照组(control组)和慢性温和应激组(chronic mild stress,CMS组);每组60只。实验动物都以高脂、高胆固醇饲料(5%猪油,1%的胆固醇)的喂养。本实验所采用的应激方案在Ipek Yalcin等建立的慢性应激模型基础上进行了改进,具体应激方案如下:垫料用水打湿17h(每周1次);昼夜颠倒7或17h(每周2次);鼠笼倾斜成45度角7或17h(每周2次);噪声刺激9或15h(每周2次,80dB);恐惧刺激1h(放入大鼠刚住过鼠笼、每周2次)。应激试验组小鼠按顺序接受每个应激源的刺激。应激组的小鼠分别在接受应激刺激0周(n=20),4周(n=20),12周(n=20)3个时间点处死动物。对照组的小鼠关在单独的实验动物房,除了不给予应激刺激外,其它的实验条件与应激组相同。分别在试验开始后的第0,4,12周3个时间点处死动物。1.2糖皮质激素浓度与蔗糖偏嗜度测定所用apoE-/-小鼠首先接受训练饮用1%的蔗糖水:在开始的48h内将蔗糖水放入鼠笼中以代替灭菌的蒸馏水,接着禁食禁水8h,通过称饮水瓶前后重量,连续测量3次动物在1h内的饮水量,计算方式如下:饮用1%蔗糖水重量=饮用前饮水瓶的重量-饮用1h后饮水瓶的重量此后每周进行一次8h禁食禁水和1h饮蔗糖水测试。采用125I-皮质酮放射性免疫检测试剂盒测定血浆皮质酮的含量,此过程贯穿于整个实验。1.3 CMS对apoE-/-小鼠主动脉AS病变面积测定从腹主动脉分叉至主动脉弓将主动脉剪下,干净剔除主动脉血管外的脂肪组织后,将主动脉树纵向剪开,主动脉树以用苏丹Ⅳ染色观察整个主动脉的病变。主动脉窦连续10μm冰冻切片进行油红O染色,观察主动脉AS病变。1.4 CMS对apoE-/-小鼠TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达水平的测定Real-time PCR芯片分析apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号途径基因表达;Western blotting方法检测apoE-/-小鼠主动脉TLR4和NF-κB的表达水平,免疫组化染色观察主动脉窦AS病变处TLR4的表达;ELISA法检测apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表达水平。2. Ad-TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展及其对主动脉TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达的研究2.1 Ad-TLR4 siRNA干扰载体构建2.1.1有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体构建设计、合成两对特异性针对TLR4基因的小分子干扰RNA序列,分别构建小分子干扰RNA载体pRNAT-TLR4-1和pRNAT-TLR4-2;阴性对照为pRNAT-H1.1/Adeno空载体。DNA测序鉴定重组质粒的正确性。2.1.2有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体筛选收集稳定筛选获得的293A- Ad-siRNA-TLR4-1、293A- Ad-siRNA-TLR4-2和293A-pNeg细胞,抽提各组细胞的总RNA和总蛋白,分别以Real time-PCR与Western blotting法检测各组细中TLR4mRNA与蛋白的表达水平;选取对TLR4抑制率高的一对进行体外大量扩增。2.1.3小分子干扰腺病毒载体的体外扩增、滴度测定以上大量扩增获得的Ad-siRNA-TLR4-2、Ad-siRNA-Neg腺病毒以不同浓度感染293A细胞,逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。2.2 TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展影响的研究4周龄雄性apoE-/-小鼠120只平衡一周后随机分为3组:(1)CMS组;(2)CMS+TLR4 siRNA组(10μl/只,尾静脉注射,每5日一次);(3)CMS+腺病毒空载体组。每组apoE-/-小鼠40只,实验动物都以高脂、高胆固醇饲料(5%猪油,1%的胆固醇)的喂养。分别在接受CMS刺激0,4,12周后3个时间点处死动物。主动脉窦连续10μm冰冻切片进行油红O染色,观察主动脉AS病变。2.3 TLR4 siRNA干扰对CNS apoE-/- TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达水平的测定分别以Real-time PCR方法检测apoE-/-小鼠主动脉TLR4和NF-κB mRNA表达水平;以Western blotting方法检测其主动脉TLR4和NF-κB蛋白质表达水平;ELISA法检测apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表达水平。结果1. CMS显著升高apoE-/-小鼠血浆糖皮质激素水平结果显示:对照组小鼠血浆中皮质酮的浓度小于100ng/ml;CMS组apoE-/-小鼠应激4周后,CMS组小鼠血浆中的皮质酮激素的水平显著高于正常对照组;而应激12周后,CMS组小鼠血浆皮质酮激素浓度大约是对照组的11倍,与相应对照组相比,其血浆皮质酮激素浓度差异有非常显著(457.3±56.5 ng/ml vs 40.2±7.2 ng/ml,P < 0.001)。2. CMS显著降低apoE-/-小鼠1%蔗糖水溶液摄取量结果表明:基线测试中应激组与对照组apoE-/-小鼠1%蔗糖水的饮用量没有差异(P > 0.05)。在整个的实验时期内(12周),对照组小鼠的摄取蔗糖量没用明显的改变;而随着应激时间的增加,CMS组小鼠1%蔗糖水的饮用量逐渐显著减少。方差分析表明,CMS对apoE-/-小鼠1%蔗糖水的饮用量的改变有着显著作用[F (1,456) = 236.47, P < 0.01]。Two-Way ANOVN方差分析表明,随着应激时间的延长,CMS对apoE-/-小鼠1%蔗糖水的饮用量明显存在着应激×时间的交互作用[F (12,456) = 141.42, P < 0.001]。3. CMS显著加速apoE-/-小鼠主动脉树AS病变的发生与发展研究结果表明:0周时,应激组与对照组的小鼠主动脉都未发生AS病变;接受4周、12周CMS刺激后的apoE-/-小鼠主动脉AS病变的面积占整个主动脉树面积的百分比分别为10.37%±2.32%和24.58%±3.81%,而相应对照组小鼠主动脉AS病变的面积占整个主动脉树面积的百分比分别为2.61%±0.57%和6.36%±1.47%;应激组主动脉的AS病变与相应对照组相比,差异显著(P < 0.01)。4. CMS显著加速apoE-/-小鼠主动脉窦AS病变的发生与发展结果表明:在实验刚开始时(0周),应激组与对照组apoE-/-小鼠主动脉窦都未发生AS病变;而经过4、12周的高脂、高胆固醇的饮食喂养后,对照组与应激组apoE-/-小鼠的主动脉窦都出现AS病变,随着时间的增加,主动脉窦AS病变显著加重。apoE-/-小鼠接受4、12周CMS刺激后,其主动脉窦AS病变与相应对照组相比较,应激组的AS病变显著加重。CMS应激12周apoE-/-小鼠主动脉窦的AS病变的面积为0.24±0.03 mm2,而相应对照组apoE-/-小鼠主动脉窦的AS病变面积仅为0.05±0.01 mm2。二者AS病变面积相比较,有显著差异(P < 0.01)。5. CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号途径基因表达的影响实验结果表明:在TLR蛋白信号转导Real-time PCR芯片检测的83个基因当中,与对照组相比较,应激组当中apoE-/-小鼠主动脉的TLRs信号转到途径中的43个基因发生了显著性的改变,二者相比差异显著,有显著统计学意义;其中15表现为上调,28个表现下调。在共9个TLR样受体基因表达中,与相应对照组相比较,应激组的TLR4基因表达增加4倍多,而其它8个TLR样基因表达减少或不变,这说明CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLRs的基因表达有差异。CMS诱导的TLR4信号转导途径激活后的基因表达中,IL-1β、TNF-α和IL-6的表达显著增加;其中IL-1β的表达增加了10倍多,与对照组相比,差异显著(P = 0.008)。6. CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达的影响0周时,对照组与CMS应激组apoE-/-小鼠的主动脉TLR4蛋白表达都比较少(0.21±0.03 vs 0.22±0.05),对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达差异无统计学意义(P >0.05)。给予4周CMS刺激后,对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达差异有统计学意义(0.25±0.08 vs 0.74±0.06,P < 0.05)。12周时,对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达差异有统计学意义(0.47±0.06 vs 1.13±0.11,P < 0.05)。0W、4W、12W的CMS应激组的组内主动脉TLR4蛋白表达统计学分析表明,其TLR4蛋白表达差异有统计学意义(P < 0.05、P < 0.05,P < 0.01)。免疫组化染色显示:CMS应激4、12周后,与相应对照组相比,应激组主动脉TLR4抗原的表达显著增强(P < 0.01)。7. Western Blotting检测CMS对apoE-/-小鼠主动脉NF-κB蛋白表达的影响结果表明:在实验开始时(0W),对照组与CMS应激组apoE-/-小鼠的主动脉NF-κB蛋白表达很少(0.13±0.02 vs 0.12±0.04,P >0.05)。给予4周(4W)CMS刺激后,相应对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉NF-κB蛋白表达差异有统计学意义(0.18±0.04 vs 0.45±0.06,P < 0.05)。而给予12周(12W)CMS刺激后,相应对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉NF-κB蛋白表达有明显差异(0.42±0.07 vs 0.95±0.13,P < 0.05)。8. ELISA法检测CMS对apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达的影响结果表明:0周时,应激组与对照组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达较低(均P >0.05)。给予4周CMS刺激后,与相应对照组相比,CMS应激组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达显著增加(分别为137.38±28.37 pg/ml vs 348.36±42.06 pg/ml,P < 0.05;82.53±16.37 ng/ml vs 176.62±24.36 ng/ml, P < 0.05;2.65±0.36 ng/ml vs 9.77±1.16 ng/ml, P < 0.05和3.16±0.46 ng/ml vs 7.51±1.06 ng/ml, P < 0.05)。而给予12周CMS刺激后,与相应对照组相比,CMS应激组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达增加更显著(分别为274.92±50.18 pg/ml vs 827.33±96.62 pg/ml,P < 0.05;265.31±36.42 ng/ml vs 586.24±86.53 ng/ml, P < 0.05;4.28±0.83 ng/ml vs 21.36±3.17 ng/ml, P < 0.01和5.14±0.93 ng/ml vs 17.84±2.28 ng/ml, P < 0.05)。9.小分子干扰RNA载体对TLR4表达的抑制效应及其腺病毒滴度测定293A- Ad-siRNA-TLR4-2细胞TLR4mRNA表达水平显著低于未转染组293A细胞,沉默率达82%;其TLR4蛋白相对表达强度显著低于未转染293A细胞,沉默率达78%。逐孔稀释滴度测定法测定的病毒滴度为3.4×1011 TU/ml。10. Ad-siRNA-TLR4对CMS apoE-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的影响结果表明: 0周时,各组的小鼠主动脉窦都未发生AS病变;而经过4、12周的高脂、高胆固醇的饮食喂养后,CMS组,CMS+TLR4 siRNA组和CMS+腺病毒空载体组apoE-/-小鼠的主动脉窦都出现AS病变,随着时间的增加,主动脉窦AS病变显著加重。apoE-/-小鼠接受4、12周CMS刺激后,CMS+TLR4 siRNA组主动脉窦AS病变分别与相应CMS组相比较,siRNA组AS病变显著减轻(1.53±0.22% vs 3.14±0.37%,P < 0.05;5.77±0.73% vs 26.82±2.14%,P < 0.01)。CMS+腺病毒空载体组apoE-/-小鼠的主动脉窦AS病变与相应CMS组相比,差异无统计学意义(P >0.05)。11. Ad-siRNA-TLR4对CMS apoE-/-小鼠主动脉TLR4 mRNA与蛋白质的表达结果表明:0周时,各组CMS apoE-/-小鼠主动脉TLR4 mRNA与蛋白质的表达表达较低(均P >0.05)。给予4周CMS刺激后,与相应CMS组相比,TLR4 siRNA干扰组apoE-/-小鼠主动脉TLR4 mRNA与蛋白质的表达均降低(0.25±0.03 vs 0.61±0.05 ,P <0.05 ; 0.23±0.03 vs 0.58±0.07,P <0.05)。12周CMS刺激后,与相应对照组相比,TLR4 siRNA组apoE-/-小鼠主动脉TLR4 mRNA与蛋白质的表达显著降低(0.24±0.02 vs 0.91±0.10, P <0.01; 0.22±0.03 vs 0.79±0.08, P <0.01)。CMS+腺病毒空载体组与相应CMS组相比,差异无统计学意义(均P >0.05)。12. Ad-siRNA-TLR4对CMS apoE-/-小鼠主动脉NF-κB mRNA与蛋白质的表达结果表明:0周时,各组CMS apoE-/-小鼠主动脉NF-κB mRNA与蛋白质的表达表达较低(均P >0.05)。4周CMS刺激后,与相应CMS组相比,TLR4 siRNA组apoE-/-小鼠主动脉NF-κB mRNA与蛋白质的表达均降低(0.21±0.03 vs 0.45±0.06,P <0.05; 0.24±0.03 vs 0.53±0.05,P <0.05)。12周CMS刺激后,与相应对照组相比,TLR4 siRNA组apoE-/-小鼠主动脉NF-κB mRNA与蛋白质的表达显著降低(0.24±0.04 vs 0.63±0.07, P <0.05; 0.27±0.03 vs 0.67±0.07, P<0.05)。CMS+腺病毒空载体组与相应CMS组相比,差异无统计学意义(均P >0.05)。13. ELISA法检测Ad-siRNA-TLR4干扰对CMS apoE-/-小鼠血清中MCP-1,sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达的影响结果表明:0周时,应激组与对照组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达较低(均P >0.05)。给予4周CMS刺激后,与相应CMS组相比,siRNA-TLR4组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达显著减少(分别为94.27±12.26pg/ml vs 326.63±29.17pg/ml , P<0.05; 63.72±6.81ng/m vs 195.83±19.67ng/ml,P<0.05; 2.27ng/ml±0.28ng/ml vs 10.61 ng/ml±1.17ng/,P <0.05; 3.26ng/ml±0.31ng/ml vs 7.18 ng/ml±0.78ng/ml, P <0.05)。12周CMS刺激后,与相应CMS组相比,siRNA-TLR4组apoE-/-小鼠血清中MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α表达减少更显著(分别为90.62±13.82pg/ml vs 754.07±61.26pg/ml, P <0.01; 58.16±6.03ng/ml vs 436.29±46.52ng/ml, P <0.01; 2.38ng/ml±0.32ng/ml vs 18.83ng/ml±1.64ng/ml, P <0.01; 3.02ng/ml±0.37ng/ml vs 15.87ng/ml±1.47ng/ml, P <0.01)。CMS+腺病毒空载体组与相应CMS组相比,差异无统计学意义(均P >0.05)。结论1.成功建立了CMS加速apoE-/-小鼠主动脉的AS的发生与发展动物模型。2. CMS能差异性地改变apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号转导途径的基因表达。3.成功构建了TLR4基因RNA干扰载体pRNT-TLR4-2。4. TLR4-siRNA干扰显著抑制CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生与发展。5. TLR4-siRNA干扰显著抑制CMS apoE-/-小鼠TLR4、NF-κB以及TLR4/NF-κB途径激活产物MCP-1, sICAM-1, IL-1β和TNF-α的表达。6. TLR4/NF-κB-MCP-1、sICAM-1、IL-1β和TNF-α信号途径在CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生与发展中有着重要作用。