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肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤和癌症死亡的主要原因，近30年生存改善并不明显。目前85%以上的肺癌患者为非小细胞肺癌，手术、放疗和化疗是治疗非小细胞肺癌最常用的三种方式。随着放射肿瘤学的不断发展，放疗已经逐渐成为多种类型恶性肿瘤局部治疗的重要方法，也是目前治疗非小细胞肺癌最有效的方法之一。然而肺癌单独放疗的疗效是令人失望的，部分肿瘤会因放疗抵抗出现局部控制失败，更重要的是肿瘤对放疗并不是完全被动的。目前许多研究表明放疗可能促进肿瘤侵袭和转移，其机制之一与血管生成和促血管生成因子有关。放疗可以同时刺激多个信号传导通路，改变VEGF等多种促血管生成因子在残存肿瘤细胞和宿主细胞的表达。此过程可能涉及多个基因，但具体机制目前仍不完全清楚。放疗联合多基因多靶点的抗肿瘤治疗已成为目前研究的新方向。APE1具有DNA损伤修复和氧化还原等多种功能，是VEGF等促血管生成因子的上游基因。我们实验室前期研究已经证实APE1对骨肉瘤血管生成具有调节作用及APE1在肺癌中表达增高和亚细胞定位改变与化疗抵抗有关。因此，我们推测APE1对肺癌血管生成和放疗诱导肺癌血管生成可能具有调节作用。本研究首先检测APE1与VEGF在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达，分析APE1与非小细胞肺癌肿瘤血管生成和预后的关系，然后进一步通过体外实验观察人肺腺癌A549细胞APE1和VEGF表达与放射线照射的剂量效应关系，并利用Ad5/F35-APE1siRNA抑制A549细胞APE1表达，研究APE1在放射诱导A549细胞VEGF表达和对内皮细胞迁移及微血管形成能力影响中的作用。研究目的1．探讨APE1在非小细胞肺癌中与肿瘤血管生成和预后的关系，分析APE1成为非小细胞肺癌抗肿瘤血管生成治疗靶点的可能性；2．探讨APE1在放疗诱导非小细胞肺癌血管生成中的作用及机制；3．探讨以APE1为靶点抑制放疗诱导肺癌血管生成联合放疗治疗非小细胞肺癌的可能性和临床应用价值。研究内容和方法1．APE1在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系：采用免疫组化法检测非小细胞肺癌肿瘤组织APE1和VEGF表达，并测定MVD，分析APE1、VEGF与MVD的关系，并分析三者及常见临床病理因素与DFS的关系。2．肺癌细胞APE1和VEGF表达与放射线照射的剂量效应关系：采用8MV X射线分别给予A549细胞2、4、6、8、10Gy单次照射，照射后48h Western blot检测各组A549细胞APE1蛋白表达和ELISA方法检测细胞培养上清液中的VEGF蛋白，以及照射后24h RT-PCR检测各组A549细胞VEGF mRNA，分析A549细胞APE1和VEGF表达与X射线照射剂量的关系。3．Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射诱导肺癌血管生成的实验研究：采用重组腺病毒载体Ad5/F35-APE1siRNA感染A549细胞，照射后48h Western blot检测APE1蛋白表达验证APE1抑制情况，再分别给予8MV X射线2、4、6、8、10Gy单次照射，照射后48h ELISA方法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白，8MV X射线4Gy单次照射Ad5/F35-APE1siRNA感染和未感染A549细胞，照射后24小时RT-PCR检测各组A549细胞VEGF mRNA水平，用同样处理后48h A549细胞培养上清液作为条件培养基与HUVEC进行Transwell双室共培养和管状结构形成实验，观察APE1在放射线照射A549细胞诱导HUVEC迁移及微血管形成中的作用。研究结果：1．APE1在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系：APE1、VEGF在NSCLC肿瘤组织中高表达率分别为77.94%和66.18%。APE1表达与性别、年龄、病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移无关（P>0.05），VEGF表达和MVD值与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关（P<0.05）。APE1与VEGF、APE1与MVD和VEGF与MVD均呈正相关（r=0.369，P=0.000；r=0.256，P=0.003；r=0.387，P=0.000）。Kaplan-Meier单因素生存分析显示肿瘤大小、淋巴结转移及APE1、VEGF、MVD与DFS密切相关（P<0.05）。COX回归模型多因素分析显示，肿瘤大小、淋巴结转移和VEGF表达是影响NSCLC患者DFS的独立危险因素。2．肺癌细胞APE1和VEGF表达与放射线照射的剂量效应关系：Western Blot显示不同剂量X射线照射后48h A549细胞APE1蛋白水平均较未照射细胞明显增加，RT-PCR结果显示不同剂量X射线照射后24h A549细胞VEGF mRNA均较未照射细胞明显增高，ELISA方法检测显示不同剂量X射线照射后48h A549细胞培养上清液中根据细胞数量标化的VEGF蛋白分泌量也均较未照射细胞明显增加，并具有剂量依赖性，APE1和VEGF表达趋势一致，而单次照射剂量超过4Gy后细胞培养上清液中总VEGF蛋白分泌量开始出现下降趋势。3．Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射诱导肺癌血管生成的实验研究： Ad5/F35-APE1siRNA感染A549细胞后48h Western Blot显示A549细胞APE1蛋白表达明显抑制，抑制率约85%，同时抑制X射线照射诱导的A549细胞APE1蛋白表达。RT-PCR和ELISA结果显示抑制APE1表达后未照射A549细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白分泌量均减少，抑制率大约是88%和60%；抑制APE1表达后给予4Gy单次照射A549细胞VEGF mRNA水平和VEGF蛋白分泌量也降低，与单纯4Gy照射细胞比较抑制率大约是88%和64%；其余不同剂量照射诱导的VEGF蛋白分泌抑制率大约是54%～65%；两因素方差分析显示X射线照射和APE1表达均对VEGF表达和分泌存在影响，两者之间存在交互作用（P<0.01）。迁移实验和管状结构形成实验显示单次4Gy X射线照射后的A549细胞培养上清液作为条件培养基在体外可促进血管内皮细胞HUVEC迁移和微血管形成，Ad5/F35-APE1siRNA抑制A549细胞APE1表达后HUVEC迁移和微血管形成的上述诱导作用明显减弱。结论1. APE1高表达与NSCLC肿瘤血管生成有密切关系，APE1并不是影响NSCLC患者无病生存的独立预后因素，APE1可能通过调控VEGF促进NSCLC肿瘤血管生成从而导致肿瘤复发或转移，影响NSCLC患者无病生存预后。2. Ad5/F35-APE1siRNA抑制人肺腺癌A549细胞APE1表达后A549细胞VEGF表达和分泌下降以及血管内皮细胞迁移和微血管形成能力降低，在体外实验中证实APE1参与调节NSCLC肿瘤血管形成，APE1是NSCLC抗血管生成治疗的潜在分子靶点，可能具有临床应用价值。3.放射线照射以剂量依赖方式诱导A549细胞APE1和VEGF表达增强，两者表达趋势一致。Ad5/F35-APE1siRNA可抑制A549细胞放射线照射诱导APE1和VEGF表达，减弱放射线照射A549细胞促进血管内皮细胞迁移以及微血管形成的能力，APE1在放疗诱导NSCLC肿瘤血管生成中起重要作用。4. Ad5/F35-APE1siRNA抑制放疗诱导肺癌血管生成，以APE1为靶点的基因治疗可通过抗肿瘤血管生成增强NSCLC放射治疗疗效，更好地在控制原发灶的同时减少远处转移。Ad5/F35-APE1siRNA与放疗联合可能成为NSCLC治疗的新方法。