华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）是一种重要的人兽共患病原,寄生在人及多种动物的肝胆管和胆囊中引起华支睾吸虫病。全球有超过2亿人存在感染华支睾吸虫的风险,而仅中国的感染人数就达1 300万之多,其中又以广东、广西和黑龙江尤为严重,对华支睾吸虫病的防控刻不容缓。粪便中检出虫卵是诊断华支睾吸虫病的金标准,但该方法敏感性低,容易漏诊,且无法进行早期诊断,临床亟需建立高效、准确的方法用于华支睾吸虫病的早期诊断。本研究利用蛋白质组学将华支睾吸虫排泄分泌抗原与不同宿主的血清互作,以期筛选出具有诊断潜力的抗原,初步建立间接ELISA诊断方法,为华支睾吸虫病诊断试剂盒的研发奠定基础。本研究主要包括三部分。（1）华支睾吸虫排泄分泌抗原（Excretory secretory products,ESPs）的制备及诊断抗原的筛选。体外培养华支睾吸虫,收集ESPs,分别与兔7 d、14 d、35 d、77 d的华支睾吸虫阳性血清、兔肝片吸虫阳性血清、兔日本血吸虫阳性血清、兔阴性血清进行免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析。ESPs中共获得了334个非冗余蛋白,通过同源比较及Uniport鉴定,在华支睾吸虫蛋白库中获得注释的有254种。将阳性血清与阴性血清结果进行第一轮差异筛选,以剔除阴性血清的成分,分别鉴定出32、18、39、35种与兔7 d、14 d、35 d、77 d阳性血清结合的差异蛋白。在一轮筛选的基础上,进行第二轮不同物种间阳性血清差异筛选,以筛除日本血吸虫及肝片吸虫的非特异性抗原,其中存在于兔7 d、14 d、35 d、77 d的特异蛋白分别有13、9、16、15种,四个时期都存在的差异蛋白有3种。（2）目的蛋白的克隆、表达及反应原性分析。结合蛋白相对表达量及生物信息学分析,初步筛选出6种具有潜在诊断价值的蛋白,分别为Dynein light chain-1（D1）、Dynein light chain-2（D2）、Myoferlin（MY）、Acetylornithine deacetylase（AD）、Phosphomethylpyrimidine synthase（PS）和Calcium-binding protein（Ca）,其中D1、D2、MY存在于华支睾吸虫生长发育的各个时期。经RT-PCR得到华支睾吸虫c DNA,设计引物分别扩增7种蛋白（选取Myoferlin抗原表位丰富位置将其截短为MY1、MY2两部分）序列,经双酶切后连接至p ET-32a载体,构建重组质粒。转化进BL21感受态细胞内,诱导表达后SDS-PAGE鉴定,其中D1、D2、Ca、PS为可溶性表达,其余为包涵体形式表达。Western Blot显示七种蛋白均与兔华支睾吸虫阳性血清反应,而不与阴性血清反应,均表现出良好的反应原性。（3）华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法的建立与初步应用。对七种蛋白的诊断效果进行初步筛选,由P/N值得出CSD2蛋白最为适合用于间接ELISA方法的建立。同时对ELISA反应条件进行优化:最佳包被液为磷酸盐缓冲液、抗原最佳包被浓度为5μg/m L,最佳显色条件为37℃恒温显色20 min,一抗及二抗最佳稀释倍数分别为1:200及1:40 000。建立的ELISA方法不与东毕吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫和大片吸虫的阳性血清发生交叉反应,表现出良好的特异性。最早能够识别人工感染7 d的华支睾吸虫阳性血清,可应用于早期诊断。本研究利用蛋白质组学在华支睾吸虫ESPs中鉴定出254个与宿主血清互作的已知蛋白,建立了可用于诊断抗原筛选的蛋白库。经生物信息学分析后,筛选出6种具备诊断候选潜力的抗原,并成功地对其进行表达及纯化,其中CSD2蛋白抗原表位丰富,具有良好的特异性和敏感性,具备成为华支睾吸虫病诊断抗原的潜力。以CSD2为诊断抗原建立的华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法,与传统虫卵检测相比,检出率更高,为华支睾吸虫病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。