CRISPR（clustered regularly interspersed short palindromic repeats,规律成簇间隔的短回文重复）/Cas9是目前最受关注的基因编辑工具,使研究人员能以手术刀般的精度,便捷、高效、经济地操纵生物体DNA。其中,直接递送Cas9/sg RNA蛋白复合物的策略,由于避免了外源核酸插入基因组和基因持续表达导致脱靶的风险,是CRISPR/Cas9走向临床安全应用的重点发展方向之一。现有的Cas9/sg RNA递送载体存在合成路线复杂、基因编辑效率低、以及不充分降解导致的细胞毒性等问题,并且难以应用于T细胞等免疫细胞类型。本课题尝试设计并构建一种新型纳米材料,以实现在活细胞中Cas9/sg RNA复合物的直接递送,并发挥高效基因编辑功能。蛋白质是天然的“转运载体”。基于仿生学构想对蛋白质进行修饰,本研究首先设计并合成了一种新型的蛋白核-聚合物壳纳米结构,使其能够高效递送负电性生物大分子。通过原位自由基聚合反应,在蛋白质表面进行不同单体和交联剂的修饰,合成了一系列不同表面性质的蛋白核-聚合物壳纳米载体。在活细胞上的评价实验结果表明,正电性蛋白纳米载体对质粒DNA等负电性生物大分子具有良好的非共价自组装负载特性,而表面修饰叔胺基团、连接阳离子基团的酯键结构有助于实现纳米载体的递送功能——前者促进了纳米载体递送生物大分子后的内体逃逸,后者在生理环境下的水解促进了生物大分子从纳米载体上解离释放。其中以2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯（2-（dimethylamino）ethyl methacrylate,DMAE MA）为单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（N,N′-methylenebisacrylamide,BIS）为交联剂的纳米载体B4取得了较好的质粒DNA递送效果,其效率达到80%,基因稳定表达4天以上。本部分研究为Cas9/sg RNA复合物递送材料的选择奠定了基础。随后建立了一种高通量的细胞筛选模型,以有效评价Cas9/sg RNA的递送效率。利用慢病毒系统,构建了携带单拷贝EGFP-PEST报告基因的细胞株。商品化脂质体的递送实验结果表明,载体向该细胞株递送靶向EGFP基因的Cas9/sg RNA复合物后,EGFP基因被破坏,细胞中EGFP-PEST融合蛋白迅速降解,荧光信号降低,从而指示基因编辑发生。该系统可在2–4天内实现基因编辑效率的定性和定量评价。本部分研究为Cas9/sg RNA复合物的递送构建了评价模型。在蛋白核-聚合物壳纳米载体递送质粒DNA的基础上,利用建立的细胞评价模型,首先评价了B4递送Cas9/sg RNA复合物的效率。结果表明,B4能够高效递送Cas9/sg RNA进入细胞,内化效率为100%,但是产生的基因编辑效率小于5%,提示复合物无法有效释放。进一步设计并合成了与B4组成接近、结构不同的纳米载体。结果表明,虽然无交联剂的纳米载体B5递送Cas9/sg RNA的内化效率低于B4,但能实现有效释放,在细胞模型上的基因编辑效率达到40%。最后通过体外模拟胞内生理环境,研究了Cas9/sg RNA从纳米载体中释放的机制以及纳米载体的结构对Cas9/sg RNA递送效果的影响。结果表明,B5自身的不稳定性、来自胞内其他阴离子分子的竞争性结合以及B5无交联剂的合成策略所产生的星型结构是使Cas9/sg RNA能够从自组装复合物中有效释放并发挥生物活性的原因。最后,利用建立的Cas9/sg RNA复合物递送系统在难转染的原代T细胞上开展基因编辑应用研究。首先对B5载体在T细胞上的递送技术方案进行了优化。研究发现,激活T细胞有助于实现Cas9/sg RNA的高效内化,重激活3天后进行Cas9/sg RNA转导的内化量是未激活细胞的约6倍,所产生的基因编辑效率达到14%左右。针对与CAR-T相关的恶性肿瘤的治疗靶点CD7和肿瘤免疫抑制关键分子PD1,分别设计靶向两种基因的sg RNA,利用B5载体进行Cas9/sg RNA递送,均在T细胞上实现了有效的基因编辑。通过经验设计和筛选,本研究建立了一种新型的蛋白核-聚合物壳的纳米结构材料,成功实现了Cas9/sg RNA复合物在活细胞上的递送和基因编辑,并探讨了该载体的递送机制,为下一步的优化和其他生物大分子的载体设计提供了理论依据和方向。同时,本研究构建的新型载体能够在T细胞上有效递送,这为下一代CAR-T细胞治疗的个性化定制奠定了技术基础。