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研究目的: 转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种具有多种生物功能的细胞因子,与肿瘤浸润转移相关的整合素avβ6在口腔鳞癌细胞中都异常高表达.而整合素avβ6的表达受关键性亚单位整合素β6(ITGB6)调控。基因的转录调控与基因启动子区转录因子的结合状态及组蛋白乙酰化修饰密切相关。本研究拟通过研究β6基因启动子区转录因子的活化状态及组蛋白乙酰化修饰状态,研究TGF-β1调控β6表达的转录调控机制,为进一步探究整合素avβ6在口腔鳞癌中过度表达的分子机制奠定基础。 材料和方法: 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人口腔鳞癌细胞,实时定量PCR以及Western blotting实验检测TGF-β1对β6表达的影响;利用mRNA稳定性实验检测TGF-β1对β6的转录水平的影响是否与mRNA的稳定性有关;进一步利用荧光素酶报告基因技术检测β6基因启动子中TGF-β1主要应答区;利用生物信息学方法并结合相关文献预测调控口腔鳞癌细胞TGF-β1诱导的β6基因转录活性的可能顺式作用元件及与之结合的转录因子;利用定点突变和染色质免疫共沉淀方法确定调控口腔鳞癌细胞TGF-β1诱导的β6基因转录活性的主要顺式作用元件及与之结合的反式作用因子;染色质免疫沉淀技术检测TGF-β1诱导的β6启动子区组蛋白乙酰化水平以及乙酰基转移酶在此区域的结合水平。 结果: 1. TGF-β1上调口腔鳞癌细胞整合素β6 mRNA和蛋白表达.mRNA稳定性实验证明TGF-β1不能增强β6 mRNA的稳定性而上调β6转录水平。 2.整合素β65’侧翼区荧光素梅报告基因质粒pGL2-B6(-3/+208)、pGL2-B6(-150/+208)、pGL2-B6(-421/+208)分别转染SAS细胞,分析TGF-β1对其影响,整合素β6启动子区-150~-421 nt是TGF-β1的主要应答区,结合生物信息学方法预测到改区域主要转录因子有AP-1、C/EBP、SRF,c-Myb对AP-1、C/EBP、SRF、c-Myb结合位点进行定点突变,结果显示,AP-1、C/EBP、SRF的潜在结合位点可能涉及TGF-β1诱导的β6转录活性,进一步用染色质免疫沉淀技术(ChIP)发现,TGF-β1促进转录因子JunB、C/EBPα、SRF在口腔鳞癌细胞中与β6基因启动子区-150~-421 nt结合增加,同时Western blotting结果显示,TGF-β1促进JunB、C/EBPα和SRF蛋白表达。 3.染色质免疫沉淀检测到TGF-β1诱导的β6启动子区-150~-421 nt的乙酰化水平以及组蛋白乙酰基转移酶CBP结合量升高,其中组蛋白H3乙酰化水平在TGF-β1作用2h时达到最高,组蛋白H4乙酰化水平和CBP结合量则在0.5h时达到最高。当用siRNA使CBP基因表达靶向沉默后,TGF-β1诱导的β6 mRNA以及蛋白水平显著降低。使用去乙酰化酶抑制剂LBH589(10μM)、SAHA(1μM)作用于SAS细胞,能使TGF-β1诱导的β6 mRNA以及蛋白表达水平升高。 结论: 1. TGF-β1诱导整合素β6 mRNA以及蛋白表达水平上调,转录水平调控是关键。 2.整合素β6启动子区对TGF-β1的主要应答区位于-150~-421 nt,TGF-β1使此区域的反式作用因子AP-1亚单位JunB,C/EBPα,SRF结合增多从而使整合素β6启动子转录活化 3.整合素β6启动子区-150~-421 nt组蛋白乙酰化水平升高参与TGF-β1诱导的整合素β6转录活化,此区域的乙酰化水平升高与乙酰基转移酶CBP结合增多有关。