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茯苓皮(Surface layer of Poria cocos,SLPC)是多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥外皮,具有利水消肿之功效,在临床上常用于治疗水肿、小便不利等症。茯苓皮中含有三萜类、二萜类、甾体类、黄酮类、蒽醌类、木脂素类等成分,其中三萜类化学成分是其主要化学成分。茯苓皮具有利尿、肾保护、抗炎、抗氧化等药理作用。肾间质纤维化(Tubulo-interstitial fibrosis,TIF)是多种慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)发展至终末期肾病的共同病理特征,有效抑制TIF进程是防治CKD的关键。本论文系统分离鉴定了茯苓皮的化学成分,阐明茯苓皮中羊毛甾烷三萜和3,4-开环羊毛甾烷三萜类化合物通过抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)、Wnt/β-catenin信号通路及TGF-β/Smad信号通路而发挥抗肾脏纤维化作用。目的:系统地研究利水渗湿中药茯苓皮的化学成分,揭示茯苓皮抗肾纤维化的物质基础及其作用机制,为茯苓皮的合理开发利用及抗肾纤维化药物研发提供理论基础和实验依据。方法:1.干燥的茯苓皮粉碎后用乙醇回流提取,减压浓缩得到浸膏,经蒸馏水混悬溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次,合并萃取液得到不同极性部位的萃取物。2.采用MCI GEL CHP 20P树脂柱、硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱、ODS RP-18反相中压柱等多种色谱技术,结合制备及半制备高效液相色谱(HPLC)等方法,对乙酸乙酯部位进行分离纯化。通过IR、HRESIMS、1D和2D NMR等波谱学方法对分离得到的单体化合物进行结构表征。3.分别采用转化生长因子β1(TGF-β1)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)和小鼠足细胞(MPC5)导致肾纤维化损伤模型。根据茯苓三萜酸化合物母核结构及所含官能团不同,选择一个三环三萜类新化合物茯苓酸ZF(PZF)、三个3,4-开环羊毛甾烷三萜类新化合物茯苓酸ZC(PZC)、茯苓酸ZD(PZD)和茯苓酸ZG(PZG),及两个羊毛甾烷三萜类新化合物茯苓酸ZE(PZE)和茯苓酸ZH(PZH)为研究对象,评价其对TGF-β1和AngⅡ介导的HK-2细胞纤维化及足细胞损伤的影响。4.通过q RT-PCR、Western blot、免疫荧光等方法检测TGF-β1和AngⅡ介导的HK-2和足细胞中RAS和Wnt/β-catenin信号通路相关基因转录和蛋白表达水平的影响,观察PZC、PZD、PZE、PZF、PZG及PZH对RAS和Wnt/β-catenin信号通路的影响。5.观察TGF-β1和AngⅡ介导的HK-2和足细胞中TGF-β/Smad信号通路的影响,进一步研究PZC、PZD、PZE、PZF、PZG及PZH对Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4及Smad7等蛋白表达的影响。6.采用单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral occlusion,UUO)法构建TIF小鼠模型,通过H&E染色观察PZC、PZD和PZE小鼠肾损伤的改善作用,Masson’s染色观察PZC、PZD和PZE对小鼠肾间质纤维化改善作用。通过q RT-PCR、Western blot等分子生物学方法,检测PZC、PZD和PZE对小鼠肾脏促纤维化蛋白表达的影响。进一步观察PZC、PZD和PZE对UUO小鼠肾组织RAS、Wnt/β-catenin及TGF-β/Smad信号通路的影响,评价其抗肾纤维化活性及构效关系。结果:1.系统的鉴定茯苓皮的化学成分。从茯苓皮乙酸乙酯部位分离鉴定100个单体化合物,包括36个3,4-开环羊毛甾烷三萜类成分:poricoic acid A(FLP-1)、poricoic acid B(FLP-2)、poricoic acid E(FLP-5)、poricoic acid ZA(FLP-6)、poricoic acid D(FLP-7)、poricoic acid F(FLP-8)、poricoic acid ZB(FLP-9)、poricoic acid ZC(FLP-10)、poricoic acid G(FLP-12)、26-hydroxy-poricoic acid DM(FLP-13)、poricoic acid ZD(FLP-14)、poricoic acid AM(FLP-17)、poricoic acid C(FLP-23)、16-deoxyporicoic acid B(FLP-24)、poricoic acid ZG(FLP-27)、3,4-seco-lanosta-7,9(11),24(25)-trien-21-oic acid 3-oate(FLP-30)、15α-hydroxylanosta-8(9),24(25)-diene-3,21-dioic acid(FLP-32)、poricoic acid ZJ(FLP-34)、poricoic acid ZK(FLP-35)、poricoic acid AE(FLP-39)、6,7-dehydroporicoic acid H(FLP-41)、poricoic acid CE(FLP-44)、poricoic acid CM(FLP-51)、poricoic acid ZM(FLP-58)、poricoic acid ZO(FLP-63)、25-methoxy-poricoic acid A(FLP-66)、poricoic acid ZQ(FLP-71)、poricoic acid ZR(FLP-72)、poricoic acid ZS(FLP-73)、poricoic acid ZT(FLP-76)、poricoic acid ZU(FLP-80)、poricoic acid BM(FLP-82)、poricoic acid ZV(FLP-83)、poricoic acid GE(FLP-87)、16α-hydroxy-3,4-seco-lanosta-4(28),7(9),11,24-tetraene-3,21-dioic acid-3-ethyl ester(FLP-89)、poricoic acid GM(FLP-97);38个羊毛甾烷三萜类成分:dehydrotrametenolic acid(FLP-3)、dehydroeburicoic acid(FLP-4)、3-epi-dehydrotumolosic acid(FLP-11)、3β,16α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid(FLP-16)、3-O-acetyl-16α-hydroxyl dehydrotrametenolic acid(FLP-18)、dehydropachymic acid(FLP-19)、pachymic acid(FLP-20)、eburicoic acid(FLP-21)、poricoic acid ZE(FLP-22)、trametenolic acid(FLP-26)、poricoic acid ZH(FLP-28)、16α-hydroxytrametenolic acid(FLP-29)、poricoic acid ZI(FLP-31)、16α-hydroxy-3-oxo-24-methyl-lanosta-5,7,9(11),24(31)-tetraen-21-oic acid(FLP-33)、poricoic acid ZL(FLP-36)、3β,15α-dihydroxy-lanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid(FLP-37)、3-epidehydropachymic acid(FLP-38)、pohyporenic acid C(FLP-40)、3α-O-acetyl-hydroxyl pachymic acid(FLP-43)、25-hydroxypachymic acid(FLP-45)、15α-hydroxy-dehydrotumulosic acid(FLP-47)、5α,8α-peroxydehydro-tumulosic acid(FLP-48)、6α-dehydropolyporenic acid C(FLP-49)、3β-O-acetyl-16α-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-oic acid(FLP-52)、3β-O-acetyl-lanosta-7,9(11),24(31)-trien-21-oic acid(FLP-55)、3-oxo-16α-hydroxy-lanosta-7,9(11),24(31)-trien-21-oic acid(FLP-61)、poricoic acid ZN(FLP-62)、3β,16α-dihydroxy-24-oxolanost-7,9(11)-dien-21-oic acid(FLP-64)、3β,15α-dihydroxy-lanosta-8,24-diene-21-oic acid(FLP-65)、poricoic acid ZP(FLP-67)、16α,27-dihydroxy-dehydrotrametenoic acid(FLP-68)、3β,16α-di-hydroxy-7-oxo-24-methyllanosta-8,24(31)-dien-21-oic acid(FLP-69)、dehydro-trametenonic acid(FLP-77)、3-oxol-anosta-8(9),24-diene-21-oic acid(FLP-78)、dehydroeburiconic acid(FLP-79)、3β,15α,16α-trihydroxy-lanosta-7,9(11),24(31)-trien-21-oic acid(FLP-81)、poricoic acid ZW(FLP-84)、3-(2-hydroxy-acetoxy)-5α,8α-peroxydehydrotumulosic acid(FLP-98);1个三环三萜类成分:poricoic acid ZF(FLP-25);5个二萜类成分:dehydroabietinol(FLP-53)、dehydroabietlc acid(FLP-54)、7-oxol-15-hydroxydehydroabietic acid(FLP-75)、dehydroabietic acid(FLP-85)、1β,16-dihydroxy-dehydroabietic acid(FLP-91);5个黄酮类成分:3’,4’,5,6,7,8-hexamethoxy-flavone(FLP-74)、4-hydroxy-3’,5,6,7,8-pentamethoxy flavone(FLP-90)、wogonin(FLP-92)、4’,5,6,7,8-pentamethoxyflavone(FLP-95)、4’,7-dihydroxy isoflavone(FLP-100);3个甾体类成分:ergosterol(FLP-46)、β-sitosterol(FLP-56)、ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one(FLP-59);1个木脂素类成分:matairesinol(FLP-60);1个蒽醌类成分:aloe-emodin(FLP-94);以及10个其他类小分子化合物:1,2-benzenedicarboxylic acid-1,2-dibutyl ester(FLP-15)、dibutyl phthalate(FLP-42)、1,2-benzenedicarboxylic acid-1,4-bis(6-methylheptyl)ester(FLP-50)、palmitic acid(FLP-57)、vanillin(FLP-70)、4,5-dihydroxy-9-methanol-12-(14,15-dimethyl)-methanol-1,7-diphenyl(FLP-86)、3,4,5-trihydroxy-benzaldehyde(FLP-88)、maltose(FLP-93)、4-hydroxy-2-nonenoic acid(FLP-96)、4,5-dihydroxy-10-methyl-11-(14,15-dimethyl)-methanol-1,7-diphenyl(FLP-99)。其中FLP-6、9、10、14、22、25、27、28、31、34、35、36、58、62、63、67、71、72、73、76、80、83、84、86、99等25个化合物为新化合物;FLP-32、37、43、60、61、74、75、79、88、90、91、92、93、94、95、96、100等17个化合物为首次从茯苓属中分离鉴定。2.茯苓三萜酸抑制TGF-β1和AngⅡ诱导的HK-2及足细胞损伤,改善UUO小鼠肾间质纤维化。TGF-β1和AngⅡ均能诱导HK-2细胞转分化,诱导足细胞损伤。3,4-开环羊毛甾烷三萜(PZC、PZD及PZG)和羊毛甾烷三萜(PZE及PZH)均可显著下调TGF-β1和AngⅡ诱导的HK-2细胞中促纤维化蛋白collagen I、fibronectin和α-SMA的表达,显著上调E-cadherin的表达;显著上调足细胞中Podocin、Nephrin、Podocalyxin及Synaptopodin蛋白的表达。PZC、PZD和PZE减少UUO小鼠肾组织中炎细胞浸润和成纤维细胞积聚,下调肾组织中促纤维化蛋白α-SMA、CollagenⅠ及Fibronectin的表达。3.茯苓三萜酸抑制RAS的激活。RT-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示TGF-β1和AngⅡ激活HK-2及足细胞中的RAS成分,上调AGT、renin、ACE及AT1R等基因转录和蛋白表达水平,茯苓三萜酸显著的抑制TGF-β1和AngⅡ诱导的细胞中RAS基因转录和蛋白表达。UUO上调肾组织RAS蛋白表达,茯苓三萜酸给药7天能抑制肾组织中激活的RAS。茯苓三萜酸可作为一种新型RAS抑制剂。4.茯苓三萜酸抑制激活Wnt/β-catenin信号通路。在HK-2和足细胞中,TGF-β1和AngⅡ均能激活β-catenin及其下游靶基因的转录,导致上调Snail1、Twist、MMP-7、PAI-1及FSP-1的表达,加速肾纤维化。茯苓三萜酸显著抑制TGF-β1和AngⅡ诱导的HK-2及足细胞中激活的Wnt/β-catenin信号通路;并能显著地抑制UUO小鼠肾组织中上调的Wnt1及下游蛋白的表达,而发挥抗纤维化作用。5.茯苓三萜酸选择性抑制Smad3磷酸化。TGF-β1是目前公认最关键的促纤因子,可通过多种途径导致肾纤维化,TGF-β/Smad信号通路可作为抗纤维化药物的靶点。实验结果显示TGF-β1和AngⅡ可激活HK-2及足细胞的TGF-β/Smad信号通路,上调p-Smad2、p-Smad3及Smad4的蛋白表达,并下调Smad7的表达。PZC、PZD、PZE、PZG及PZH选择性抑制HK-2及足细胞中磷酸化的Smad3水平,对Smad4、Smad7和磷酸化的Smad2的蛋白表达水平没有显著影响。茯苓三萜酸能选择性抑制UUO引起的小鼠肾组织中磷酸化的Smad3水平。6.茯苓三萜酸3位羧基和侧链羟基是抗肾纤维化活性的增效基团。体外和体内实验证明3,4-开环羊毛甾烷三萜酸PZD对肾纤维化的抑制作用强于PZC,二者均强于羊毛甾烷三萜酸PZE,此外PZG的活性强于PZH,这表明羊毛甾烷三萜酸的A环断开生成羧基后有助于增强其抗肾纤维化活性,此外侧链(24位及31位)羟基数量的增多能够增强抗肾纤维化活性。结论:本研究从茯苓皮中分离鉴定100个化合物,其中25个新化合物,17个已知化合物为首次从茯苓属中分离鉴定;基于TGF-β1和AngⅡ介导的HK-2和足细胞模型及UUO小鼠肾脏纤维化模型,揭示了3,4-开环羊毛甾烷三萜酸PZC、PZD和PZG,羊毛甾烷三萜酸PZE和PZH通过抑制RAS,Wnt/β-catenin信号通路及选择性抑制Smad3的磷酸化而发挥抗肾纤维化作用。该研究进一步丰富了利水渗湿中药茯苓皮的化学成分,揭示了茯苓皮发挥抗肾纤维化作用的分子机制,为开发新型抗肾纤维化药物提供了先导化合物,为茯苓皮的合理开发应用提供了理论基础和实验依据。