研究背景和目的：　　中医学认为脾为后天之本，气血生化之源。“脾主运化”是脾的主要生理功能，对水谷精微的消化、吸收、代谢起着重要作用。脾虚是脾气虚损引起的脾生理功能失常的病理现象，脾虚则运化失常，会影响一系列营养物质如糖类、蛋白质、脂类以及微量元素的消化吸收，改变酶的活性，并导致代谢障碍。　　葡萄糖是维持细胞能量代谢和机体生命活动的重要物质，从饮食中获取。有研究表明脾虚状态下葡萄糖的吸收减少，代谢发生异常。葡萄糖在小肠中的吸收主要有两个途径：主动转运和易化扩散。主动转运由高亲和力、低容量的转运蛋白-钠依赖性葡萄糖转运蛋白SGLT1介导，易化扩散由低亲和力、高容量的葡萄糖转运蛋白GLUT2介导。现在已知低葡萄糖浓度下SGLT1主要负责葡萄糖的转运吸收，随着葡萄糖浓度增加SGLT1会达到饱和状态，当葡萄糖浓度超过SGLT1的转运能力时，GLUT2成为葡萄糖摄取的主要运载蛋白。因此可以推测脾虚时糖吸收障碍可能与GLUT2的转运能力下降有关。调控GLUT2的因素很多，甜味受体、Ca2+都能调控其表达。甜味受体T1R2+T1R3属于G蛋白偶联受体超级家族，通过两个G蛋白介导的包含α-味导素和/或转导素的信号系统起作用，该系统与PLCβ2或PKA相关，从而分别增加细胞内Ca2+和甘油二酯或cAMP。GLUT2调控通路是PKCβⅡ依赖性通路，而PKCβⅡ需要Ca2+的激活，同时Ca2+对于伴随葡萄糖吸收的肠上皮细胞的骨架重排是必需的。细胞处于静息态时， PLCβ2和PKCβⅡ以非活性形式存在于细胞质中，细胞受刺激后它们迅速到达顶膜，在这里PLCβ2产生甘油二酯以激活PKCβⅡ，导致GLUT2嵌入顶膜转运葡萄糖。另外，饮食、能量代谢和激素等因素也对GLUT2具有重要的调节作用。　　益气健脾中药对脾虚证糖吸收障碍具有较好的改善作用，推测与GLUT2表达的改变有关。本研究从脾虚大鼠模型和体外 Caco-2细胞葡萄糖吸收障碍模型两个方面，观察益气健脾中药人参对葡萄糖吸收的影响，探讨其改善糖吸收可能的作用机制。　　研究方法：　　一、人参的药效考察　　分别用利血平和大黄建立脾虚大鼠模型，给予人参水提液进行治疗，观察人参对脾虚大鼠葡萄糖吸收障碍的改善作用，同时用Western Blotting检测GLUT2蛋白表达，荧光定量PCR检测GLUT2 mRNA的表达，探讨人参的作用机理。　　二、Caco-2细胞葡萄糖吸收模型的建立　　观察 Caco-2细胞的生长状况，并根据细胞动态分析仪绘制的生长曲线筛选细胞种植密度。同时基于LC-MS技术建立同位素-质谱联用测定13C-D-葡萄糖的方法，进行方法学考察，为葡萄糖的定量提供基础。在检测方法建立的基础上考察 Caco-2细胞培养时间、葡萄糖刺激浓度和刺激时间对葡萄糖吸收的影响，选择合适的造模条件。　　三、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1药效的考察　　在建立的Caco-2细胞葡萄糖吸收模型上考察葡萄糖转运蛋白抑制剂根皮苷和根皮素，以及人参皂苷Rg1、Rb1对Caco-2细胞吸收葡萄糖的影响，用LC-MS测定13C-D-葡萄糖含量，并检测GLUT2蛋白表达和mRNA的表达，考察受试药的药效。　　研究结果：　　一、人参的药效考察　　经人参治疗后，脾虚大鼠精神状态好转，脾虚症状有所减轻，尿D-木糖排泄率增加，空肠对葡萄糖的吸收量也明显升高，效果优于自然恢复组。各组大鼠肠粘膜GLUT2蛋白表达的结果表明，给予人参治疗后GLUT2蛋白表达量上升，与自然恢复组相比有明显差异。与模型组相比，人参治疗组大鼠肠粘膜 GLUT2 mRNA的表达量明显增加，但是与自然恢复组相比没有显著差异。　　二、Caco-2细胞葡萄糖吸收模型的建立　　Caco-2细胞生长均匀、致密，形态正常，表现出旺盛的增殖活性。用细胞动态分析仪绘制生长曲线，经换算后选择6×105/mL的细胞种植密度。　　采用内标法，以三氯蔗糖做为内标。色谱条件：以乙腈与0.1％甲酸为流动相，线性梯度洗脱。质谱条件：选择电喷雾电离源（ESI），以选择反应监测（SRM）方式进行监测；13C-D-葡萄糖母离子峰 m/z185，主要碎片离子峰 m/z92.47；。三氯蔗糖主要母离子峰 m/z395，碎片离子峰 m/z359。方法学考察的结果表明建立的方法精密度高，重复性好，待测物13C-D-葡萄糖稳定性和回收率良好。　　Caco-2细胞生长融合后培养21天，其结构类似于小肠上皮细胞，分化出微绒毛，可以用于葡萄糖吸收实验。同时选取浓度为75 mM的葡萄糖溶液，孵育10 min较为适宜。　　三、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1药效的考察　　中剂量和高剂量的根皮苷都能显著抑制 Caco-2细胞对葡萄糖的吸收，而根皮素的高、中、低剂量组葡萄糖的吸收量与正常对照组相比差异均有统计学意义，各组吸收的葡萄糖含量显著降低。　　人参皂苷Rg1终浓度分别为100、50、25μM时，Caco-2细胞生长较快，达到平台期的时间缩短。终浓度分别为50、25、12.5μM的人参皂苷Rb1能提高Caco-2细胞指数，促进细胞增殖，当给药剂量高于100μM时，细胞增殖速度放缓。　　只加入人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的情况下，葡萄糖的吸收与正常对照组相比差异没有统计学意义。而在含有抑制剂根皮素时，低剂量的人参皂苷Rg1和高剂量的人参皂苷Rb1能改善根皮素对Caco-2细胞糖吸收的抑制作用，促进葡萄糖的吸收；在根皮苷存在条件下，人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1高、中、低剂量均下调 Caco-2细胞吸收的葡萄糖含量。　　分别用根皮苷和根皮素抑制后，两组Caco-2细胞中GLUT2蛋白表达均下降，且根皮素组下降更明显。用根皮素处理的细胞，给予人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1后，细胞中GLUT2蛋白表达有下降的趋势，但是与根皮素组相比差异不明显。用根皮苷处理的Caco-2细胞，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1可以下调GLUT2的蛋白表达。根皮苷和根皮素都可以降低 GLUT2 mRNA的表达，根皮素组与正常组相比差异有统计学意义。在根皮素抑制的基础上加入人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1后，下调的GLUT2 mRNA表达有所上升，在根皮苷作用的基础上，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对GLUT2 mRNA的影响不明显。　　结论：　　在利血平和大黄建立的脾虚模型中，人参能够改善脾虚状态下的葡萄糖吸收障碍，其作用的发挥与葡萄糖转运蛋白GLUT2有关，通过增加GLUT2的蛋白表达促进葡萄糖的吸收。　　在 Caco-2细胞葡萄糖吸收模型和13C-D-葡萄糖检测方法建立的过程中，使用的LC-MS方法灵敏度高、准确性好，适用于药理实验中细胞样本分析的要求。　　根皮苷和根皮素对 Caco-2细胞吸收葡萄糖有抑制的作用，可以做为工具药，在体外模拟脾虚状态下的葡萄糖吸收障碍。人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1能改善该病理状态下的葡萄糖吸收，其作用的产生与GLUT2有关。