论文部分内容阅读
研究背景和目的: 中医学认为脾为后天之本,气血生化之源。“脾主运化”是脾的主要生理功能,对水谷精微的消化、吸收、代谢起着重要作用。脾虚是脾气虚损引起的脾生理功能失常的病理现象,脾虚则运化失常,会影响一系列营养物质如糖类、蛋白质、脂类以及微量元素的消化吸收,改变酶的活性,并导致代谢障碍。 葡萄糖是维持细胞能量代谢和机体生命活动的重要物质,从饮食中获取。有研究表明脾虚状态下葡萄糖的吸收减少,代谢发生异常。葡萄糖在小肠中的吸收主要有两个途径:主动转运和易化扩散。主动转运由高亲和力、低容量的转运蛋白-钠依赖性葡萄糖转运蛋白SGLT1介导,易化扩散由低亲和力、高容量的葡萄糖转运蛋白GLUT2介导。现在已知低葡萄糖浓度下SGLT1主要负责葡萄糖的转运吸收,随着葡萄糖浓度增加SGLT1会达到饱和状态,当葡萄糖浓度超过SGLT1的转运能力时,GLUT2成为葡萄糖摄取的主要运载蛋白。因此可以推测脾虚时糖吸收障碍可能与GLUT2的转运能力下降有关。调控GLUT2的因素很多,甜味受体、Ca2+都能调控其表达。甜味受体T1R2+T1R3属于G蛋白偶联受体超级家族,通过两个G蛋白介导的包含α-味导素和/或转导素的信号系统起作用,该系统与PLCβ2或PKA相关,从而分别增加细胞内Ca2+和甘油二酯或cAMP。GLUT2调控通路是PKCβⅡ依赖性通路,而PKCβⅡ需要Ca2+的激活,同时Ca2+对于伴随葡萄糖吸收的肠上皮细胞的骨架重排是必需的。细胞处于静息态时, PLCβ2和PKCβⅡ以非活性形式存在于细胞质中,细胞受刺激后它们迅速到达顶膜,在这里PLCβ2产生甘油二酯以激活PKCβⅡ,导致GLUT2嵌入顶膜转运葡萄糖。另外,饮食、能量代谢和激素等因素也对GLUT2具有重要的调节作用。 益气健脾中药对脾虚证糖吸收障碍具有较好的改善作用,推测与GLUT2表达的改变有关。本研究从脾虚大鼠模型和体外 Caco-2细胞葡萄糖吸收障碍模型两个方面,观察益气健脾中药人参对葡萄糖吸收的影响,探讨其改善糖吸收可能的作用机制。 研究方法: 一、人参的药效考察 分别用利血平和大黄建立脾虚大鼠模型,给予人参水提液进行治疗,观察人参对脾虚大鼠葡萄糖吸收障碍的改善作用,同时用Western Blotting检测GLUT2蛋白表达,荧光定量PCR检测GLUT2 mRNA的表达,探讨人参的作用机理。 二、Caco-2细胞葡萄糖吸收模型的建立 观察 Caco-2细胞的生长状况,并根据细胞动态分析仪绘制的生长曲线筛选细胞种植密度。同时基于LC-MS技术建立同位素-质谱联用测定13C-D-葡萄糖的方法,进行方法学考察,为葡萄糖的定量提供基础。在检测方法建立的基础上考察 Caco-2细胞培养时间、葡萄糖刺激浓度和刺激时间对葡萄糖吸收的影响,选择合适的造模条件。 三、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1药效的考察 在建立的Caco-2细胞葡萄糖吸收模型上考察葡萄糖转运蛋白抑制剂根皮苷和根皮素,以及人参皂苷Rg1、Rb1对Caco-2细胞吸收葡萄糖的影响,用LC-MS测定13C-D-葡萄糖含量,并检测GLUT2蛋白表达和mRNA的表达,考察受试药的药效。 研究结果: 一、人参的药效考察 经人参治疗后,脾虚大鼠精神状态好转,脾虚症状有所减轻,尿D-木糖排泄率增加,空肠对葡萄糖的吸收量也明显升高,效果优于自然恢复组。各组大鼠肠粘膜GLUT2蛋白表达的结果表明,给予人参治疗后GLUT2蛋白表达量上升,与自然恢复组相比有明显差异。与模型组相比,人参治疗组大鼠肠粘膜 GLUT2 mRNA的表达量明显增加,但是与自然恢复组相比没有显著差异。 二、Caco-2细胞葡萄糖吸收模型的建立 Caco-2细胞生长均匀、致密,形态正常,表现出旺盛的增殖活性。用细胞动态分析仪绘制生长曲线,经换算后选择6×105/mL的细胞种植密度。 采用内标法,以三氯蔗糖做为内标。色谱条件:以乙腈与0.1%甲酸为流动相,线性梯度洗脱。质谱条件:选择电喷雾电离源(ESI),以选择反应监测(SRM)方式进行监测;13C-D-葡萄糖母离子峰 m/z185,主要碎片离子峰 m/z92.47;。三氯蔗糖主要母离子峰 m/z395,碎片离子峰 m/z359。方法学考察的结果表明建立的方法精密度高,重复性好,待测物13C-D-葡萄糖稳定性和回收率良好。 Caco-2细胞生长融合后培养21天,其结构类似于小肠上皮细胞,分化出微绒毛,可以用于葡萄糖吸收实验。同时选取浓度为75 mM的葡萄糖溶液,孵育10 min较为适宜。 三、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1药效的考察 中剂量和高剂量的根皮苷都能显著抑制 Caco-2细胞对葡萄糖的吸收,而根皮素的高、中、低剂量组葡萄糖的吸收量与正常对照组相比差异均有统计学意义,各组吸收的葡萄糖含量显著降低。 人参皂苷Rg1终浓度分别为100、50、25μM时,Caco-2细胞生长较快,达到平台期的时间缩短。终浓度分别为50、25、12.5μM的人参皂苷Rb1能提高Caco-2细胞指数,促进细胞增殖,当给药剂量高于100μM时,细胞增殖速度放缓。 只加入人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的情况下,葡萄糖的吸收与正常对照组相比差异没有统计学意义。而在含有抑制剂根皮素时,低剂量的人参皂苷Rg1和高剂量的人参皂苷Rb1能改善根皮素对Caco-2细胞糖吸收的抑制作用,促进葡萄糖的吸收;在根皮苷存在条件下,人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1高、中、低剂量均下调 Caco-2细胞吸收的葡萄糖含量。 分别用根皮苷和根皮素抑制后,两组Caco-2细胞中GLUT2蛋白表达均下降,且根皮素组下降更明显。用根皮素处理的细胞,给予人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1后,细胞中GLUT2蛋白表达有下降的趋势,但是与根皮素组相比差异不明显。用根皮苷处理的Caco-2细胞,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1可以下调GLUT2的蛋白表达。根皮苷和根皮素都可以降低 GLUT2 mRNA的表达,根皮素组与正常组相比差异有统计学意义。在根皮素抑制的基础上加入人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1后,下调的GLUT2 mRNA表达有所上升,在根皮苷作用的基础上,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对GLUT2 mRNA的影响不明显。 结论: 在利血平和大黄建立的脾虚模型中,人参能够改善脾虚状态下的葡萄糖吸收障碍,其作用的发挥与葡萄糖转运蛋白GLUT2有关,通过增加GLUT2的蛋白表达促进葡萄糖的吸收。 在 Caco-2细胞葡萄糖吸收模型和13C-D-葡萄糖检测方法建立的过程中,使用的LC-MS方法灵敏度高、准确性好,适用于药理实验中细胞样本分析的要求。 根皮苷和根皮素对 Caco-2细胞吸收葡萄糖有抑制的作用,可以做为工具药,在体外模拟脾虚状态下的葡萄糖吸收障碍。人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1能改善该病理状态下的葡萄糖吸收,其作用的产生与GLUT2有关。