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草鱼(Cyenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的经济鱼类,每年草鱼出血病的爆发,严重影响了草鱼养殖业的健康发展。草鱼出血病的病毒性病原为草鱼呼肠孤病毒,草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae),水生呼肠孤病毒属。自20世纪80年代分离到第一株草鱼呼肠孤病毒以来,目前已有40多株见于文献报道,目前从患病鱼体内分离到的病毒,根据其基因序列,可以划分为3种基因型:Ⅰ型、Ⅱ型、III型。根据流行病学调查显示,Ⅱ型是目前国内分布最广、流行最为严重、致病力最强的病毒类型。Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的11个基因节段共编码11个蛋白,对各基因编码的蛋白功能预测分析,发现S8节段编码的VP41蛋白功能未知,在其他基因型的草鱼呼肠孤病毒中未能找到与之对应的同源蛋白。VP41作为II型草鱼呼肠孤病毒特有的蛋白,可能与II型草鱼呼肠孤病毒特有的一些生物学特性相关,研究VP41的功能,对于阐明草鱼呼肠孤病毒的致病机理具有重要意义。本论文以草鱼呼肠孤病毒河南分离株GCRV-HN14作为研究对象,旨在研究VP41在病毒复制中的作用。首先应确定VP41蛋白是否定位到病毒的包涵体中,病毒包涵体是病毒在细胞中形成的圆形或椭圆形结构,是病毒进行各组分装配的重要场所。I型草鱼呼肠孤病毒NS80蛋白能够形成病毒包涵体的基本框架结构,并且能够招募病毒的其他结构蛋白和非结构蛋白进入到病毒包涵体内。在II型草鱼呼肠孤病毒中,与NS80同源的蛋白为S4基因节段编码的NS79蛋白。本文主要通过研究VP41和NS79在细胞中的共定位,以及VP41与病毒其他蛋白的相互作用来阐述VP41是否参与到病毒的装配中。本文的主要内容如下:1.VP41和NS79蛋白相互作用的免疫荧光检测以GCRV-HN14病毒的基因组为模板,克隆了VP41和NS79的ORF,并分别插入到pc DNA3.1(+)真核表达载体,双酶切和测序验证重组载体构建成功。将构建好的真核表达载体转染CIK细胞,转染24 h后收取细胞,免疫荧光检测重组蛋白在细胞中的表达和定位。单独转染pc DNA3.1-NS79时,S4基因节段编码的NS79蛋白在细胞质中能够形成圆形团块状结构,与NS80蛋白的功能类似,也能够形成病毒包涵体的基本结构。单独转染pc DNA3.1-VP41时,S8编码的VP41蛋白在细胞质中呈不规则的块状分布。当两种载体pc DNA3.1-NS79和pc DNA3.1-VP41共同转染CIK细胞时,显示VP41蛋白和NS79蛋白都呈现不规则的块状分布,且两个蛋白共定位,表明两者有相互作用。2.草鱼呼肠孤病毒VP41和NS79蛋白多克隆抗体的制备以GCRV-HN14病毒的基因组为模板,扩增VP41和NS79的部分片段,将扩增的片段分别插入p ET-32a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性菌,测序验证结果无误后,阳性菌扩大培养,提取重组质粒VP41E-32a和NS79E-32a。将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选阳性菌。对阳性菌进行IPTG诱导,超声破碎菌体,蛋白电泳检测显示重组蛋白以包涵体的形式存在于破碎后的沉淀中。通过镍柱Ni-IDA纯化重组蛋白,用纯化的VP41蛋白100μg注射小鼠,纯化的NS79蛋白1 mg注射新西兰大白兔,免疫4次后采血,检测多克隆抗体的效价,结果显示两蛋白的抗体效价均高于1:64000。Western blot验证抗体的特异性强,将用于病毒感染的细胞中VP41和NS79蛋白的相互作用检测。3.GCRV-HN14其它基因节段真核表达载体的构建为了检测VP41蛋白与病毒其它蛋白的相互作用,以GCRV-HN14病毒的基因组为模板,对基因节段S1、S2、S3、S5、S6、S7、S9、S10、S11的ORF进行扩增,在基因节段的羧基末端添加了HA标签序列,并分别将这些片段的ORF插入到pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经过双酶切和测序验证后,成功构建了真核表达载体pc DNA3.1-VP1、pc DNA3.1-VP2、pc DNA3.1-VP3、pc DNA3.1-VP5、pc DNA3.1-VP4、pc DNA3.1-VP56、pc DNA3.1-VP6、pc DNA3.1-NS38和pc DNA3.1-VP35。