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该研究工作主要包括以下三个部分:第一部分:用番茄MT sHSP cDNA(LeHSP23.8)内部特异引物gMT/F、gMT/R,对番茄(Lycopersicon esc μ llentum)中疏四号基因组DNA进行PCR扩增,产物连入T载体测序,发现基因内部有245bp内含子.第二部分:用位于番茄MT sHSP cDNA下游的单一酶切位点EcoR Ⅰ,与能克隆入pBS Ⅱ(KS+)的8种酶(BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、Sac Ⅰ、Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Xho Ⅰ)分别双酶切番茄"中蔬4号"基因组DNA,以含有内含子的Mt sHSP基因片段为探针做Southern杂交;根据Southern杂交结果,预测MT sHSP基因上游调控区物理图谱.结果显示,Kpn Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切的基因组DNA的杂交片段约3Kb,包括2Kb左右的上游调控序列,适合于建质粒文库.因此,回收Kpn Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切的基因组DNA 3Kb左右的片段,连入同样酶切的pBSⅡ KS+载体中,转化大肠杆菌感受态,复苏后摇菌,提取质粒,因而建成含有MT sHSP基因上游调控区2Kb左右的质粒文库.用巢式PCR方法对质粒文库进行扩增,得到的片段进行序列测定,从而克隆出MT sHSP基因起始密码子上游1915bp的上游调控序列,包括了MT sHSP基因起始密码子上游的5UTR区.在PlantCARE数据库中搜索我们分离到的MT sHSP基因启动子后,发现在启动子序列中除了TATA-box、CAAT外,还有典型的热激蛋白调控所必需的热休克元件HSE以及其它一些与胁迫反应有关的元件ABRE、C-repeat_DRE、TCA-element、AP-1等.第三部分:为了检测MT sHSP基因上游调控区的活性,将克隆的1.9Kb全长调控区构建入植物表达载体pBl121中,得到由MT sHSP基因启动子驱动GUS基因表达的TMP-pBI重组表达载体.然后将TMP-pBI重组质粒用冻融法转化农杆菌,利用叶圆盘法对番茄进行Ti质粒介导的遗传转化,同时以组成性CaMV35S启动子驱动GUS基因表达的pBl121载体作为阳性对照.通过分析该启动子对各种逆境胁迫的反应,即GUS基因的表达,从而对该启动子进行评价.该实验已检测到在高温和冷害条件下GUS基因的表达,说明该启动子对多种逆境胁迫有反应,因此该启动子可作为植物逆境专用的多效启动子.该启动子应用植物基因工程方面可以避免导入基因的组成性表达,不会影响植物的正常发育,是一种适合多种逆境胁迫的启动子,特别适用于多功能抗性基因.