前言:诱导分化成为近几年肿瘤治疗的一项新策略。全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)作为经典的诱导分化剂已应用于急性早幼粒细胞白血病临床治疗中，但有关实体肿瘤细胞的诱导分化尚处于科学研究阶段。喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一。近年来，喉癌在中国尤其东北地区发病率呈逐年升高趋势，放化疗的治疗效果欠佳，而且患者术后五年生存率依然较低，缺乏有效的治疗措施。因此，研究诱导分化剂对喉癌细胞分化的影响及其调节机制，将对寻找喉癌发生发展的分子靶标、探索喉癌诊断和治疗的新方法产生深远意义。　　ATRA通过参与诸多信号通路调控许多重要生物学过程。ATRA能够磷酸化p38MAPK并使其核转位入核进而引起Msk1发生磷酸化，随后磷酸化Msk1通过募集多种转录因子至下游靶基因的启动子区，调控其下游靶基因的转录活性。此外，ATRA与维甲酸受体(retinoic acid receptor，RAR)结合能够抑制PI3K/Akt信号通路，保护GSK-3β不被Akt磷酸化而失去活性。随后，GSK-3β有机会磷酸化β-catenin并促使其被泛素识别发生降解，最终导致β-catenin不能进入细胞核与TCF/LEF协同作用激活包括OCT4和SOX2在内的诸多基因。　　MicroRNA(miRNA)是一类保守性很高，长约20～23个核苷酸的小分子非编码RNA，通过与靶基因3非翻译区互补结合使靶基因mRNA降解或翻译抑制。miRNA通过调控靶基因参与许多生物学过程。研究发现，miRNA在多种肿瘤中均存在异常表达并在肿瘤的发生发展中发挥重要功能，是肿瘤诊断治疗及预后判定的重要靶标。miR-27a是近年来发现的一重要miRNA，作为miR-23a-27a-24-2基因簇成员之一，能够调控多种细胞的分化。但有关miR-27a是否参与喉癌细胞分化未见相关报道。　　通过生物信息学软件预测，我们发现GSK-3β和miR-23a-27a-24-2基因簇分别是miR-27a和RARα的潜在靶基因。研究证实，GSK-3β在诸多肿瘤发生发展过程中表达异常，且能通过不同信号通路调控多种细胞分化过程。RARα属于维甲酸受体家族成员，通常作为配体激活的转录因子调控其下游靶基因的转录，且与多种细胞的分化调节有关。而GSK-3β和RARα是否在喉癌细胞分化中发挥作用及作用机制尚不清楚。综上，我们推测ATRA可能通过调控miR-27a、GSK-3β和RARα三者所在的调控网络诱导喉癌细胞的分化，这也是本研究的主要研究目标和创新之处。　　因此，本研究拟通过相关分子生物学技术检测全反式维甲酸对喉癌细胞分化的诱导作用及miR-27a对ATRA诱导喉癌细分化的影响，并鉴定miR-27a、GSK-3β和RARα三者的调控关系。根据上述研究结果进一步探讨miR-27a是否通过RARα和GSK-3β相关信号通路调控ATRA诱导的喉癌细胞分化，明确miR-27a参与喉癌细胞分化的调控网络。　　材料与方法:　　1、实验材料:人喉癌细胞系Hep2、人胚肾细胞系HEK293T和喉癌及癌旁组织标本。　　2、实验方法:细胞培养、基因瞬时转染实验、Real-time PCR检测、Westernblot检测、荧光素酶报告基因活性检测、染色质免疫沉淀、CCK-8细胞增殖能力检测、细胞形态学观察、统计分析。　　结果:　　1、Real-time PCR结果显示，miR-27a在喉癌组织中表达水平较癌旁组织显著增高（P＜0.05），而且，随喉癌组织分化程度升高，miR-27a表达水平逐渐降低（P＜0.05）。　　2、生物信息学软件预测结果显示，GSK-3β的3-UTR区存在miR-27a结合位点，提示GSK-3β是miR-27a一潜在靶基因。荧光素酶报告基因活性检测结果表明，在HEK293T和Hep2细胞中，miR-27a mimic和野生型表达载体共转染组报告基因活性显著低于其他对照组（P＜0.05）。　　3、Real-time PCR结果显示，miR-27a相关小RNA各转染组Hep2细胞中GSK-3β mRNA表达量无显著差异(P＞0.05)。Western blot结果显示，miR-27a mimic转染组Hep2细胞中GSK-3β蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），miR-27a inhibitor转染组Hep2细胞中GSK-3β蛋白表达水平显著上调(P＜0.05)，提示miR-27a抑制GSK-3β翻译。　　4、Real-time PCR结果显示，随着ATRA浓度的增加，Hep2细胞中miR-27a表达水平呈逐渐降低的趋势(P＜0.05)，提示ATRA能够抑制Hep2细胞中miR-27a的内源性表达。　　5、生物信息学软件预测结果显示，miR-23a-27a-24-2基因簇启动子区存在RARα潜在结合位点。染色质免疫沉淀结果表明，RARα能与miR-23a-27a-24-2基因簇启动子结合，且ATRA能够促进RARα与该启动子的结合能力。　　6、荧光素酶报告基因活性检测结果显示，ATRA能够显著降低miR-23a-27a-24-2基因簇启动子区转录活性，而敲减RARα则显著回复ATRA对其转录活性的影响（P＜0.05）。　　7、CCK-8检测结果显示，随ATRA药物浓度的增加，Hep2细胞的增殖能力和细胞活力逐渐降低(P＜0.05)。光镜下观察发现，ATRA处理Hep2细胞后，细胞边缘发生皱缩，呈梭型，胞突变长，细胞间隙扩大，生长缓慢;透射电镜下观察发现，ATRA处理Hep2细胞后，细胞表面微绒毛减少，趋于平滑，核质比例减小。过表达miR-27a可抑制ATRA引起的Hep2细胞形态学改变。　　8、Real-time PCR和Western blot结果显示，ATRA显著上调Involucrin和Keratin10基因mRNA及蛋白表达水平，显著下调OCT4和SOX2基因mRNA及蛋白表达水平，而过表达miR-27a或敲减GSK-3β均能显著回复ATRA对上述标志物表达水平的影响（P＜0.05）。　　9、Western blot结果显示，ATRA显著下调β-catenin和LEF1基因蛋白表达水平，而过表达miR-27a则显著回复ATRA对该信号通路相关蛋白表达水平的影响(P＜0.05)，提示miR-27a抑制ATRA诱导喉癌Hep2细胞分化是通过靶向调控Wnt/β-catenin信号通路实现的。　　结论:　　1、miR-27a在喉癌组织中高表达，与喉癌细胞分化程度呈负相关并抑制ATRA诱导的喉癌细胞分化。　　2、RARα作为转录因子可与miR-27a启动子区结合并抑制其转录活性。　　3、GSK-3β是miR-27a下游靶基因之一。　　4、RARα通过抑制miR-27a靶向调控GSK-3β/β-catenin信号通路促进ATRA诱导的喉癌细胞分化。