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类叶牡丹是东北地区抗类风湿性关节炎的民间药物,它既有抗炎、镇痛作用,又有免疫调节作用。前期研究发现,发挥抗炎免疫作用的组分为皂苷和生物碱类成分。然而,其发挥作用的具体环节和靶点尚不清楚。本文,从其抗炎作用入手,以脂多糖诱导RAW264.7细胞为炎症模型,从细胞、基因、蛋白、分子水平上,对类叶牡丹及其特征成分的抗炎作用机制进行初步研究。目的:本文以类叶牡丹及其特征性成分为模型药物,建立LPS诱导的RAW264.7的炎症模型,筛选出类叶牡丹抗炎活性较强的成分进行分子机制的研究。方法:1.利用MTT方法检测类叶牡丹及其特征成分对RAW264.7细胞的毒性,以便确定后续实验的给药浓度。2.构建细胞炎症反应模型。用脂多糖刺激RAW264.7细胞,使其产生炎症。利用Griess试剂法检测类叶牡丹及其特征成分的抗炎活性,并进行比较筛选出活性较强的成分。3.利用Real-time PCR检测细胞因子TNF-α、MCP-1、IL-10的表达情况。4.采用流式细胞术检测药物对细胞表面辅助分子CD14和TLR4表达的影响。5.采用western blot法检测药物对NF-KB信号通路中的IKKβ、IkBou NF-κB和MAPK信号通路中pJNK、pERK、p-p38蛋白表达的影响。结果:MTT法测定结果显示葳严仙皂苷D、葳严仙皂苷G、葳严仙皂苷H、LeonticinD、常春藤皂苷元、N-甲基金雀花碱的浓度为100μM时,其细胞存活率都高于50%,木兰碱、齐墩果酸、刺囊酸、葳严仙皂苷C、渗漉提取物 24h 的 IC50 为 78.772μM、46.234μM、13.539μM、11.500μM和0.499mg/ml。通过Griess试剂法检测类叶牡丹及其特征成分的抗炎活性,筛选出类叶牡丹渗漉提取物和葳严仙皂苷C进行后续机制研究。Real-time PCR结果表明,给药组中炎性因子TNF-α、MCP-1的表达下降,IL-10表达升高。流式细胞术检测给药组能够降低细胞表面辅助分子CD14和TLR4表达。对MAPK信号通路和NF-κB通路的相关蛋白表达不同程度的升高和降低,CLC对和pERK、pJNK、p-p38、IKKβ和NF-κBp65都有抑制作用,且对pERK和p-p38的抑制作用与药物浓度呈正相关,使IKBα表达量增加;渗漉提取物对pERK、pJNK、p-p38和IKKβ有抑制作用,高剂量时使NF-κB p65表达量降低,渗漉提取物使IκBα表达量降低。结论:在体外成功建立了细胞炎症反应模型,发现类叶牡丹渗漉提取物及其10个单体有不同程度的抗炎作用,且成功筛选出类叶牡丹渗漉提取物和葳严仙皂苷C。初步确定了类叶牡丹渗漉总提取物和葳严仙皂苷C对MAPK信号通路和NF-κB通路的作用靶点。为阐明类叶牡丹抗炎机制提供可行性依据,也为炎症机制研究提供了技术和方法。