【摘 要】
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目的:TMEM16A广泛表达于各种哺乳动物的细胞中,参与到人生理功能调控和疾病产生发展。目前关于TMEM16A的研究主要集中于其本身的晶体结构及其在肿瘤、囊性纤维化、高血压等等疾病中的病理生理作用,但其是否参与了急性胰腺炎发生发展的过程尚未见报导。急性胰腺炎是胰腺的一种急性化学性炎症,目前临床上治疗急性胰腺炎的手段仅为对症支持治疗,缺乏特异性治疗药物。大量证据表明,胰腺腺泡细胞内游离的钙离子浓度升
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目的:TMEM16A广泛表达于各种哺乳动物的细胞中,参与到人生理功能调控和疾病产生发展。目前关于TMEM16A的研究主要集中于其本身的晶体结构及其在肿瘤、囊性纤维化、高血压等等疾病中的病理生理作用,但其是否参与了急性胰腺炎发生发展的过程尚未见报导。急性胰腺炎是胰腺的一种急性化学性炎症,目前临床上治疗急性胰腺炎的手段仅为对症支持治疗,缺乏特异性治疗药物。大量证据表明,胰腺腺泡细胞内游离的钙离子浓度升高是急性胰腺炎发生发展的始动因素,但其发病机制尚未完全阐明。本研究主要将TMEM16A、IP3R、钙离子、NFκB等信号分子有机的结合,旨在阐明雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞模型中,高表达的TMEM16A通过活化IP3R-Ca2+-NFκB信号通路促进急性胰腺炎发生发展,该研究为开发治疗急性胰腺炎的新药物靶点提供理论支持。方法:1、应用膜片钳技术的whole-cell记录模式,记录实验条件下,不同钙离子浓度对雨蛙肽对TMEM16A电流的影响;2、无钙内外液中转染TMEM16A-scramble表达载体及转染TMEM16A-sh RNA表达载体AR42J细胞所具有的内源性TMEM16A钙激活氯电流以及加入TMEM16A抑制剂T16Ainh-A01后钙激活氯电流的变化。3、使用蛋白-蛋白免疫共沉淀技术观察IP3R与TMEM16A在细胞内的结合作用。4、使用Fluo-4钙结合荧光染料在共聚焦显微镜下观察转染过表达TMEM16A载体或加入T16Ainh-A01的AR42J细胞的内质网实时钙释放过程。5、Western-Blot技术检测不同实验条件下TMEM16A蛋白表达量及NFκB核表达量与胞质表达量之比。结果:whole-cell膜片钳记录模式,结果表明在AR42J细胞中,TMEM16A的激活需要较高浓度的Ca2+;敲降TMEM16A的AR42J细胞降低雨蛙肽诱导的钙激活的氯电流增加;加入T16Ainh-A01处理的AR42J细胞降低雨蛙肽诱导的钙激活的氯电流增加。蛋白-蛋白免疫共沉淀结果表明IP3R与TMEM16A存在蛋白结合。应用FLUO-4钙结合荧光染料在共聚焦显微镜下发现使用T16Ainh-A01抑制内质网的Ca2+释放过程;过表达TMEM16A的AR42J细胞能够促进IP3R介导的钙释放增加。Western blot结果显示:高表达TMEM16A,NFκB核转位增加。雨蛙肽诱导的AP模型中:NFκB核转位增加;加入BAPTA后,NFκB的核转位减少;敲降TMEM16A,NFκB的核转位减少。结论:在本次实验课题中,我们旨在阐明雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞模型中,高表达的TMEM16A通过活化IP3R-Ca2+-NFκB信号通路促进急性胰腺炎发生发展:1)IP3R与TMEM16A存在两者之间蛋白相互结合:TMEM16A在急性胰腺炎细胞模型中高表达可通过IP3R调节细胞内钙离子浓度;2)胰腺腺泡细胞内升高的Ca2+可活化NFκB信号通路。
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